發(fā)布時間：2017-09-05 18:42

  本文關(guān)鍵詞：人源性阿爾茨海默病噬菌體抗體庫的構(gòu)建及Aβ單鏈抗體的篩選與初步效價研究

  更多相關(guān)文章： 阿爾茨海默病 噬菌體抗體庫 單克隆抗體 β-淀粉樣蛋白 抗體治療

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種與年齡相關(guān)度較高的神經(jīng)變性疾病,是老年期癡呆的主要原因,其引起的并發(fā)癥是導致老年人死亡的最常見原因之一。臨床表現(xiàn)以記憶障礙、認知障礙和精神障礙為主。由聚集在神經(jīng)細胞外的以β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)為主要成分的老年斑(Senile plaques,SP),和聚集在神經(jīng)細胞內(nèi)的由過度磷酸化的Tau蛋白形成的纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles,NFT)共同構(gòu)成AD的重要病理改變。在AD的相關(guān)研究中,基于AD發(fā)病病因的多個假說被相繼提出:例如膽堿能假說、Aβ假說、Tau蛋白假說和炎性因子假說等。最近的研究通常采用最普遍接受的Aβ假說,但Aβ假說對這種束手無策的疾病復雜的病理生理過程還是無法完美的解釋。做為老年斑主要構(gòu)成成份的Aβ在體內(nèi)的生成是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)通過β和"-分泌酶剪切得來,APP屬于跨膜蛋白,其跨膜胞外部分可以被#-分泌酶或β-分泌酶(BACE1)切割,從而產(chǎn)生兩類N端具有可溶性的APP大片段,即APPs#和APPsβ,其相對應的殘留在細胞膜上的C端APP片段分別為CTF#和CTFβ。然后CTF#和CTFβ可以分別由"-分泌酶(PS1)水解剪切產(chǎn)生Aβ片段。AD患者體內(nèi)形成的Aβ蛋白有多種存在形式:可溶性Aβ單體、寡聚體、不可溶的Aβ纖維等,無論何種形式的Aβ蛋白對神經(jīng)細胞都具有毒性,會導致神經(jīng)細胞變性,繼而發(fā)生凋亡,其中關(guān)鍵的問題是哪種結(jié)構(gòu)的aβ類型與ad的發(fā)病機理聯(lián)系最密切。在既往很長一段時間人們認為在細胞外異常沉積的aβ蛋白是ad的病理標記物,它也被認為是啟動神經(jīng)細胞變性和程序性死亡的重要病因。但最近的研究數(shù)據(jù)顯示,最早生成于細胞內(nèi)的具有可溶性的aβ單體及寡聚物往往是真正啟動ad發(fā)病過程的關(guān)鍵所在,與aβ纖維相比具有更強烈的神經(jīng)毒性,其中可溶性的寡聚體被認為與ad的發(fā)病,病情進展密切相關(guān),可溶性aβ寡聚體的水平被認為在疾病的發(fā)病過程中尤其重要。最近的研究也特別強調(diào)了aβ寡聚體在突觸的損傷中占主導地位,在ad病理性標記物中是僅有的參與到大腦功能損傷的信號。而且它也構(gòu)成淀粉樣斑塊、啟動和促進了ad的病情發(fā)展。aβ片段生成后,aβ縮氨酸自發(fā)地聚集成為可溶性的aβ寡聚體,這些寡聚物形成的纖維,繼而形成不溶的片狀結(jié)構(gòu)而最終堆積成為彌漫性斑塊。aβ1-42寡聚體是由神經(jīng)元和相關(guān)聯(lián)的星型膠質(zhì)細胞的共同作用下產(chǎn)生,它能夠引起氧化應激損傷,加速tau蛋白的過度磷酸化,從而造成對突觸和線粒體的毒性作用。aβ1-42寡聚體擁有對富含膽固醇的膜表面持久的損傷能力,這些主要存在于少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)髓鞘中。目前的研究提示aβ1-42寡聚體在ad的損傷中占主要地位。針對于aβ1-42寡聚體的靶向免疫治療可能是解鎖ad治療困境的有力鑰匙�？贵w庫技術(shù)是篩選不同生物抗體的有力工具,具體是將外源性多肽表達于噬菌體的表面�？贵w庫技術(shù)被用來篩選及鑒定人源化治療性抗體。約30%用于臨床治療性抗體是應用抗體庫技術(shù)開發(fā)所得。除去治療的價值,抗體庫技術(shù)正逐漸在研究領(lǐng)域被用于識別及鑒定的目的。表達在抗體庫表面的抗體或外源性多肽通常是依賴于目的基因的核酸序列與噬菌體外殼蛋白融合而實現(xiàn)的。在抗體庫技術(shù)中,噬菌體是包含外來目的多肽核苷酸序列的展示系統(tǒng)。從抗體庫中篩選抗體有多次的生物淘選過程。每一次的淘選都使抗體得到進一步的富集,可通過增加淘選的次數(shù)使抗體得到有效富集。高親和力的抗體保留,低親和力的抗體被洗脫掉。多次生物淘選后,僅有高親和力的特異性抗體被保留下來。這使快速簡便篩選單克隆抗體成為可能。特異性抗體基于不同的特性而被篩選出來,這使抗體庫技術(shù)成為抗體篩選和工程化的有效途徑。噬菌體抗體庫技術(shù)是生產(chǎn)特異性抗體的重要來源,為ad的單克隆抗體治療提供了基礎(chǔ)和保障。本系列研究以此為切入點,分三個部分探討ad的單克隆抗體治療的機制。第一部分,目的:構(gòu)建人源性阿爾茨海默病噬菌體抗體庫。方法:抽取20例ad病人的外周血,提取總rna,應用rt-pcr法得到人抗體vh和vl基因。將vh和vl連接,制備出scfv片段,然后將其酶切,再克隆到pcantab5e噬菌體載體上,電轉(zhuǎn)化tg1感受態(tài)菌,輔助噬菌體m13k07超感染,構(gòu)建出噬菌體單鏈抗體庫。結(jié)果:從ad病人的外周血中成功提取總rna,逆轉(zhuǎn)錄pcr擴增vh,vl可變區(qū)基因,連接形成單鏈抗體,最終構(gòu)建了庫容為2.0$108的單鏈抗體庫。bstnⅠ酶切鑒定構(gòu)建的抗體庫具有良好的多樣性。結(jié)論:成功地構(gòu)建了噬菌體展示的抗人阿爾茨海默病單鏈抗體庫,為進一步篩選抗體,繼而為ad治療的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分,目的:篩選anti-aβ1-42特異性抗體。方法:以aβ1-42寡聚體為抗原,經(jīng)過4輪“吸附-洗脫-擴增”三步驟的生物淘選過程,并且在每輪結(jié)束時用洗脫得到的噬菌體來再次重復感染大腸桿菌,將其均勻涂布與sobag平板上,統(tǒng)計收獲的百分率。在第四輪中,用篩選富集得到的陽性重組噬菌體來感染tgl,將其均勻涂布于sobag平板上。遵循隨機化原則來挑取克隆,在輔助噬菌體m13k07的挽救下,分別生產(chǎn)出重組噬茵體抗體,用elisa方法對篩選到的陽性克隆進行誘導表達,sds-page和westernblot應用于特異性鑒定。結(jié)果:噬菌體抗體收獲百分率呈上升趨勢。大部分克隆產(chǎn)生的重組噬菌體都有較高的抗原結(jié)合活性。結(jié)論:4輪篩選后單克隆抗體得到有效富集。我們挑選活性最高的11a5進行下一步的研究。第三部分,目的:所篩選出的anti-aβ1-42抗體11a5進行初步效價研究。方法:將11a5、商品化抗體6e10分別與aβ1-42寡聚體混合后腦定位注射于sd大鼠,對照組僅注射aβ1-42,30天后行morris水迷宮實驗。將11a5,6e10分別經(jīng)腹膜內(nèi)注射于app-ps1模型鼠,每兩周一次。分別于治療后1,2,3月分析外周血中aβ的水平,腦組織中aβ的水平。結(jié)果:30天后水迷宮實驗顯示抗體混合組的sd大鼠較抗體注射組的大鼠行為學改變不明顯;app-ps1小鼠治療后1,2,3月的外周血的aβ水平上升,腦組織中aβ下降,水迷宮實驗顯示學習記憶能力有明顯改善。以治療后1個月最明顯。結(jié)論:11a5能夠結(jié)合aβ1-42使其失活,并且降低app-ps1模型鼠腦組織內(nèi)aβ的水平,外周血中aβ的升高提示單克隆抗體對腦內(nèi)的aβ有驅(qū)除致其外流的作用。本系列研究成功構(gòu)建了人源性阿爾茨海默病噬菌體抗體庫,并通過4輪“吸附-洗脫-擴增”生物淘選使陽性克隆達到有效富集,挑選出活性最高的人源性單克隆抗體11a5。通過動物實驗證明11a5不僅能夠直接與aβ1-42寡聚體結(jié)合使其失活,而且能使腦內(nèi)的Aβ外流到外周,同時降低腦內(nèi)Aβ的水平,使Aβ的聚集受限。本系列研究為AD的單克隆抗體治療提供了初步的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 噬菌體抗體庫 單克隆抗體 β-淀粉樣蛋白 抗體治療
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-15
• 縮略詞中英文索引15-16
• 引言16-24
• 文獻綜述24-39
• 第一部分 人源性阿爾茨海默病噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建39-68
• 前言39-40
• 材料與方法40-60
• 實驗結(jié)果60-65
• 討論65-68
• 第二部分 從人源性阿爾茨海默病噬菌體單鏈抗體庫中篩選anti-Aβ1-42特異性抗體68-87
• 前言68-69
• 材料與方法69-78
• 實驗結(jié)果78-84
• 討論84-87
• 第三部分anti- Aβ1-42單克隆抗體對APP-PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的治療作用觀察87-103
• 前言87-88
• 材料與方法88-96
• 實驗結(jié)果96-100
• 討論100-103
• 參考文獻103-119
• 全文總結(jié)與創(chuàng)新點119-121
• 博士期間參與科研項目一覽121-122
• 博士期間發(fā)表論文一覽122-123
• 致謝123

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