本文關(guān)鍵詞：素馨苦苷干預(yù)阿爾茲海默癥的治療效果與機(jī)制研究

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【摘要】：目的:阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD),又名老年性癡呆,是一種使腦功能衰退的神經(jīng)退行性疾病。患者臨床多表現(xiàn)出記憶力、定向力、理解力等障礙,并伴隨智力衰退,嚴(yán)重者生活不能自理。其主要病理特征有大腦皮層出現(xiàn)β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集形成的老年斑(senile plaque,SP)和Tau蛋白過(guò)度磷酸化導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)。近年,隨著我國(guó)老齡人口基數(shù)擴(kuò)增、人口結(jié)構(gòu)老齡化,AD患病率也隨之增長(zhǎng),給家庭、社會(huì)都帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。然而,AD的臨床治療一直面臨著缺乏有效藥物的困難。因此,深入研究AD發(fā)病機(jī)理以及尋找可用于臨床治療AD的藥物是目前治療AD的首要任務(wù)。素馨苦苷(Jasminin)亦稱(chēng)迎春花素,是一種裂環(huán)烯醚萜葡糖苷類(lèi)(secoiridoid glucosides),其單體具有一定的抑菌活性。有研究表明,Jasminin能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α,并激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路,但Jasminin其在治療AD方面的研究尚未有報(bào)道。本文研究了Jasminin素馨苦苷在體外分子水平上對(duì)Aβ_(1-42)聚集的抑制作用,也研究了其在原代神經(jīng)細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因AD小鼠上對(duì)AD病理相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。。方法:采用硫磺素-T(ThT)熒光法,檢測(cè)不同濃度的Jasminin等九種中藥成分對(duì)50μmol/L Aβ_(1-42)單體體外聚集及隨時(shí)間變化的作用效果用;圓二色譜儀(CD)檢測(cè)2mmol/L Jasminin作用下,Aβ_(1-42)單體體外聚集12小時(shí)所形成纖維的結(jié)構(gòu)變化;用原子力顯微鏡觀察與Jasminin共孵育12小時(shí)后,Aβ_(1-42)單體體外形成纖維形態(tài)及數(shù)量變化;以N2A-SW細(xì)胞系作為AD細(xì)胞模型,用免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)AD病理相關(guān)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的變化;免疫熒光法檢測(cè)小鼠海馬區(qū)原代神經(jīng)元tau蛋白磷酸化(pTau396)和微管(Tubulin)的分布情況。以飲水方式、按100mg/kg/day的劑量給野生型小鼠和3×Tg AD小鼠喂藥30天后檢測(cè)行為學(xué)變化以及用Western-blot檢測(cè)腦組織AD病理相關(guān)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果:ThT熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),九種中藥有效成分單體在高濃度對(duì)Aβ_(1-42)體外聚集有抑制效果,其中Ginsenoside Re抑制效果最佳,有效抑制濃度范圍在10~00μmol/L;Panaxatriol,Loganin,Ginsenoside Rg1,Jasminin與Artemisinin次之,有效抑制濃度范圍在20~100μmol/L;Helicid與Ginsenoside R0效果最差。通過(guò)CD譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Jasminin可以阻礙β-sheet的產(chǎn)生,從而抑制Aβ_(1-42)聚集。采用原子力顯微鏡觀察到Jasminin對(duì)Aβ_(1-42)成纖維起抑制作用,纖維形成數(shù)量顯著減少,延伸速度明顯降低。Jasminin降低N2A-SW細(xì)胞的APP蛋白表達(dá)水平(p=0.0001),增加總tau蛋白(Tau5,p=0.0017)和GSK3β在第9位絲氨酸的磷酸化(GSK3β-pS9,p=0.0082)含量,減少tau在多個(gè)位點(diǎn)的磷酸化(Tau-pS396,p=0.0005;Tau-pS422,p=0.0009)和GSK3β在第26位酪氨酸的磷酸化(GSK3β-pY216,p=0.0294)的表達(dá)量,從而降低胞內(nèi)磷酸化水平。此外,Jasminin對(duì)突觸有保護(hù)作用,增加N2A-SW細(xì)胞PSD95表達(dá)量(p=0.0017),減少神經(jīng)元Tau-pS396水平,穩(wěn)定神經(jīng)元末梢微管結(jié)構(gòu)。喂藥30天后3×Tg AD小鼠認(rèn)知能力有所提高(p=0.0385),Aβ級(jí)聯(lián)通路相關(guān)蛋白APP(p=0.0163)、sAPPβ(p=0.0115)、Bace-1(p=0.0085)和Aβ(p=0.0078)在AD鼠腦內(nèi)含量均有顯著性降低;不同位點(diǎn)Tau的磷酸化Tau-pS396(p=0.0207)、Tau-pS404(p=0.0311)和Tau-pT231(p=0.0474)水平降低。結(jié)論:Jasminin對(duì)Aβ_(1-42)體外聚集及延伸有一定的抑制效果,能明顯抑制AD模型細(xì)胞N2A-SW中Tau蛋白磷酸化,能降低神經(jīng)元中Tau蛋白的磷酸化和磷酸化Tau蛋白的聚集、減少病理狀態(tài)下神經(jīng)元的損傷。進(jìn)一步的小鼠實(shí)驗(yàn)表明:Jasminin能提高3×Tg小鼠認(rèn)知能力,降低APP,sAPPβ和Bace-1的表達(dá)水平從而減少腦內(nèi)Aβ含量,減少Tau蛋白在不同位點(diǎn)的磷酸化水平從而阻止AD小鼠腦中NFT的形成。上述結(jié)果提示Jasminin值得作為抗AD新藥進(jìn)行深入研究。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默癥 素馨苦苷 β-淀粉樣蛋白(Aβ) Tau蛋白
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 第1章 文獻(xiàn)綜述12-23
• 1.1 阿爾茨海默癥概述12
• 1.2 AD發(fā)病機(jī)制概述12-15
• 1.2.1 AD的遺傳學(xué)基礎(chǔ)12-13
• 1.2.2 Aβ 淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)13-14
• 1.2.3 異常磷酸化Tau蛋白導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)假說(shuō)14
• 1.2.4 其它發(fā)病機(jī)制假說(shuō)14-15
• 1.3 AD相關(guān)藥物的研究進(jìn)展15-19
• 1.3.1 以氧自由基和炎癥為靶點(diǎn)的藥物研究16
• 1.3.2 以膽堿能系統(tǒng)為靶點(diǎn)的藥物研究16-17
• 1.3.3 以Tau蛋白為靶點(diǎn)的藥物研究17-18
• 1.3.4 以Aβ 為靶點(diǎn)的藥物研究18-19
• 1.4 中藥有效成分治療阿爾茨海默病的研究19-20
• 1.4.1 中藥有效成分對(duì)Aβ 的拮抗作用19-20
• 1.4.2 中藥有效成分減少Tau蛋白的異常磷酸化20
• 1.5 素馨屬植物有效化學(xué)成分治療疾病的研究進(jìn)展20-21
• 1.6 本實(shí)驗(yàn)研究目的和意義21-23
• 第2章 材料及方法23-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-30
• 2.1.1 小鼠模型、細(xì)胞模型23
• 2.1.1.1 動(dòng)物模型23
• 2.1.1.2 細(xì)胞模型23
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物23-24
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及試劑盒24-27
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器27-28
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)主要試劑的配制28-30
• 2.1.5.1 Western Blot試劑28-29
• 2.1.5.2 細(xì)胞免疫熒光試劑29
• 2.1.5.3 細(xì)胞系培養(yǎng)試劑29-30
• 2.1.5.4 原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)試劑30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-43
• 2.2.1 Aβ_(1-42)的寡聚化處理30
• 2.2.2 Th T熒光法30-31
• 2.2.4 圓二色譜法31-32
• 2.2.5 原子力顯微鏡掃描觀察32
• 2.2.5.1 AFM的Aβ_(1-42)樣品制備32
• 2.2.5.2 AFM掃描及結(jié)果分析32
• 2.2.6 Western blot檢測(cè)N2A-SW細(xì)胞系A(chǔ)D相關(guān)蛋白表達(dá)變化32-38
• 2.2.6.1 N2A-SW細(xì)胞系的培養(yǎng)32-33
• 2.2.6.2 Western Blot檢測(cè)N2A-SW細(xì)胞系相關(guān)蛋白的表達(dá)情況33-38
• 2.2.7 新生鼠海馬區(qū)原代神經(jīng)元免疫熒光觀察38-40
• 2.2.7.1 新生鼠海馬區(qū)神經(jīng)元培養(yǎng)38-39
• 2.2.7.2 新生鼠鼠海馬區(qū)神經(jīng)元免疫熒光觀察39-40
• 2.2.8 小鼠空間探索能力、焦慮情況及學(xué)習(xí)能力的觀察40-43
• 2.2.8.1 小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)40-41
• 2.2.8.2 小鼠電跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)41-43
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-69
• 3.1 九種中藥有效成分單體抗Aβ_(1-42)聚集效果篩選43-48
• 3.1.1 Th T熒光法檢測(cè)中藥有效成分單體對(duì)Aβ_(1-42)體外聚集的影響43-44
• 3.1.2 九種中藥有效成分單體不同濃度下對(duì)Aβ_(1-42)聚集的抑制效果44-48
• 3.2 Jasminin對(duì)Aβ_(1-42)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響48-49
• 3.3 Jasminin抑制Aβ_(1-42)聚集的原子力顯微鏡觀察49-50
• 3.4 Jasminin對(duì)AD模型細(xì)胞N2A-SW的保護(hù)作用50-61
• 3.4.1 Jasminin對(duì)N2A-SW細(xì)胞活力的影響50
• 3.4.2 Jasminin對(duì)N2A-SW細(xì)胞內(nèi)Aβ 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響50-53
• 3.4.2.1 N2A-SW細(xì)胞蛋白濃度的測(cè)定50-51
• 3.4.2.2 Aβ 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化51-53
• 3.4.3 Jasminin對(duì)N2A-SW細(xì)胞內(nèi)Tau通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響53-57
• 3.4.4 Jasminin對(duì)N2A-SW細(xì)胞突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響57
• 3.4.5 Jasminin對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)Tau-p S396水平的影響57-59
• 3.4.6 Jasminin對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)tubulin表達(dá)水平的影響59-61
• 3.5 Jasminin對(duì) 3×Tg AD小鼠模型的保護(hù)作用61-69
• 3.5.1 Jasminin對(duì) 3×Tg AD小鼠模型的空間探索及焦慮情況的影響61
• 3.5.2 Jasminin對(duì) 3×Tg AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響61-62
• 3.5.3 Jasminin對(duì) 3×Tg AD鼠腦內(nèi)Aβ 相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響62-64
• 3.5.4 Jasminin對(duì) 3×Tg AD鼠腦內(nèi)tau相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響64-66
• 3.5.5 Jasminin對(duì) 3×Tg AD鼠腦內(nèi)皮層 β 型糖元合成酶激酶3（GSK-3β ）表達(dá)水平的影響66-67
• 3.5.6 Jasminin對(duì) 3×Tg AD鼠腦內(nèi)磷酸酶 2（PP2A）表達(dá)水平的影響的影響67-69
• 第4章 討論69-74
• 4.1 Jasminin抑制Aβ_(1-42)體外聚集69-70
• 4.2 Jasminin在N2A-SW細(xì)胞和神經(jīng)元內(nèi)的治療效果70-72
• 4.3 Jasminin在 3×Tg AD小鼠腦內(nèi)的治療效果72-74
• 第5章 結(jié)論74-75
• 參考文獻(xiàn)75-80
• 致謝80-81
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果81

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本文編號(hào)：785661