本文關(guān)鍵詞：實驗性血管性認知障礙關(guān)于膽堿能機制的研究

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【摘要】：背景和目的：目前諸多研究證明中樞膽堿能機制參與了VaD的發(fā)病。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CHAT)、乙酰膽堿酯酶(ACHE),囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運體(VACHT)是膽堿能系統(tǒng)的重要組成部分,維持著乙酰膽堿(ACH)的動態(tài)平衡。本文將探索VaD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化及其海馬CHAT、ACHE、VACHT蛋白表達的變化,并觀察不同作用機制的藥物鹽酸多奈哌齊、丁苯酞(NBP)、紅花黃色素(HSYO)、芬戈莫德(FTY720)對VaD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和海馬BDNF、VEGF、CHAT、 ACHE、VACHT的影響,從而為VaD的藥物治療提供多方向新的靶點和理論依據(jù)。 方法：本實驗采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法(2V0)建立VaD大鼠模型,運用水迷宮方法檢測VaD大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,首次同時應(yīng)用western blot方法、免疫熒光染色檢測VAD大鼠海馬CHAT、ACHE、VACHT的蛋白表達,來觀察膽堿能機制與VaD的關(guān)系。并應(yīng)用丁苯肽、紅花黃色素、FTY720對VAD大鼠進行干預(yù),同時應(yīng)用western blot方法、免疫組化染色或免疫熒光染色的方法,以及Real Time PCR方法,首次檢測上述藥物對大鼠海馬CHAT、ACHE、VACHT、VEGF、BDNF表達的影響,觀察上述藥物對VaD大鼠膽堿能系統(tǒng)和空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。 結(jié)果：1：1.1模型組大鼠每日的逃避潛伏期均比正常組(C組)和假手術(shù)組(S組)明顯延長(P0.05)。模型組大鼠目標象限百分率明顯低于正常組和假手術(shù)組(P0.05)。 1.2模型組大鼠海馬區(qū)CHAT、ACHE、VACHT蛋白表達與正常對照和假手術(shù)比較明顯下調(diào)。 1.3HE染色：正常組和假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)細胞邊界清楚,胞質(zhì)呈淡紅色,胞核呈藍色,突起整齊排列于福射層,高倍鏡下可見部分核仁。VaD模型組大鼠海馬CA1區(qū)細胞層數(shù)和數(shù)量減少,排列紊亂,細胞體積明顯縮小,部分細胞呈空泡樣變,大量細胞發(fā)生死亡,可見核固縮、核破裂,細胞突起結(jié)構(gòu)不清,甚至消失,可見大量炎性細胞浸潤。 1.4模型組海馬區(qū)CHAT、ACHE、VACHT免疫熒光染色與模型組比較表達明顯減少。2：2.1定位航行實驗顯示各組大鼠通過5天的訓(xùn)練均建立了空間記憶能力�？臻g探索實驗顯示多奈哌齊(A)組目標象限百分率顯著高于模型組(0)(P0.05)。丁苯酞組(D)的目標象限百分率顯著高于模型組(0)組(P=0.018),且與A組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.527)。紅花黃色素組(H)的目標象限百分率明顯高于0組(P=0.05),H組與A組相比無明顯差異(P=0.430)。TY720組(F)目標象限百分率高于0組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.109),且低于A組,差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.149)。 2.2western blot結(jié)果顯示：除多奈哌齊以外的各治療組海馬CHAT、ACHE、 VACHT的表達較模型組均有升高。多奈哌齊組的ACHE表達較治療組輕度減低,CHAT、VACHT仍比模型組升高。FTY720組(F)、丁苯酞組(D)與模型組(0)組比較,BDNF表達上調(diào)。多奈呱齊組(A)、紅花黃色素組(H)的BDNF表達與模型組比較均無明顯差異。VaD模型組(0) VEGF的表達較假手術(shù)組(S)顯著上調(diào)。多奈呱齊組(A)降低VEGF的表達最為明顯。紅花黃色素組(H)、FTY720組(F)與S組比較無明顯差異,與0組比較表達下調(diào)。丁苯酞組(D)比假手術(shù)組明顯上調(diào),與0組比較無明顯差異。 2.3Real Time PCR結(jié)果顯示：海馬區(qū)CHAT的mRNA表達：模型組(0)與S組比較mRNA水平明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001),多奈哌齊組(A)、HYSA組(H)、FTY720組(F)及NBP組(D)與0組比較均有升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(其中A、D組與0比較P0.001,H、F組P0.05)。H、F組較A組減低(P0.05),D組與A組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。海馬區(qū)ACHE的mRNA表達：模型組(0)與S組比較明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001),A組比0組降低,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。D組與A組、0組顯著升高(P0.001),H、F比0組升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。H組比A組顯著升高P0.05)。海馬區(qū)VACHT的mRNA表達：模型組(0)與S組比較明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001),A、H、F、D較0組均升高,其中A、H、D與0的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(依次為P0.01,P0.05,P0.01)。而A、H、F、D組間無顯著差異。海馬區(qū)VEGF的mRNA表達：模型組(0)與S組比較明顯升高(P0.001), A、H、F組與0比較顯著減低,有統(tǒng)計學(xué)意義(依次為P0.001,P0.05,P0.01)。D組與0組比無明顯差異。H、F、D組與A組比較顯著升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(依次為P0.01,P0.05,P0.001)。海馬區(qū)BDNF的mRNA表達：模型組(0)與S組比較輕度 下調(diào),但無統(tǒng)計學(xué)差異。A、H、F、D較0組均升高,但只F、D組有統(tǒng)計學(xué)意義(依次為為P0.001,P0.01),F、D組與A組比較也升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 2.4HE染色：各干預(yù)組大鼠海馬CA1區(qū)細胞層數(shù)和數(shù)量基本正常,排列清楚,細胞體積無明顯縮小,無明顯空泡樣變,僅少量細胞可見核固縮、核破裂,細胞突起排列相對整齊。炎性細胞浸潤明顯減少,特別是FTY720組,多奈哌齊組。 2.5免疫組化染色： 2.5.1各組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)均可見VEGF免疫組化反應(yīng)陽性細胞,為棕色深染。VaD模型組(0)較正常組和假手術(shù)組表達顯著增多,丁苯酞組(D)比假手術(shù)組明顯增多,與模型組比較無明顯差異。多奈呱齊組(A)與模型組比較降低VEGF的表達最為明顯。紅花黃色素組(H)、FTY720組(F)與假手術(shù)組比較無明顯差異,與模型組比較表達減少。 2.5.2BDNF免疫組織化學(xué)陽性細胞主要集中在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)錐體細胞和DG顆粒細胞,為棕色深染。與對照組比和假手術(shù)組比較,模型組BDNF免疫反應(yīng)陽性表達輕微減少。丁苯酞組(D)、FTY720組與模型組比較,BDNF免疫反應(yīng)陽性表達明顯增多。多奈呱齊組(A)、紅花黃色素組(H)與模型組比較,無明顯差異。 2.6免疫熒光染色顯示CHAT、ACHE、VACHT均為丁苯酞組(D)、FTY720組、紅花黃色素組(H)與模型組比較免疫熒光染色陽性表達增多。多奈呱齊組(A)的ACHE免疫熒光染色陽性表達比模型組略減少,而海馬細胞形態(tài)、數(shù)排列與模型組無明顯差異。多奈呱齊組的CHAT、VACHT表達比模型組增多。結(jié)論1.雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法(2V0法)制作大鼠VaD模型,可以有效模擬人類低灌注導(dǎo)致彌漫性腦缺血缺氧所致病理改變,具有穩(wěn)定性可重復(fù)性。 2.VaD大鼠海馬CHAT、ACHE、VACHT蛋白表達減少,mRNA表達減少。與其學(xué)習(xí)和記憶成績下降相一致,提示CHAT、ACHE、VACHT表達降低可能參與了VaD的發(fā)病。 3.多奈哌齊可顯著提高VaD大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,增加海馬CHAT、VACHT的蛋白及mRNA表達,減少ACHE的表達,同時減少VEGF的表達。提示多奈哌齊除了通過抑制膽堿脂酶增加乙酰膽堿含量的直接作用以外,還可能通過抑制了炎癥損傷而保護了膽堿能神經(jīng)元,從而改善了VaD大鼠的空間記憶。為膽堿能抗炎通路理論提供了有效依據(jù)。 4.丁苯酞可以顯著提高VaD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力,與多奈哌齊組無明顯差異。丁苯酞可以顯著提高海馬區(qū)BDNF、CHAT、ACHE、VACHT蛋白及mRNA的表達。提示丁苯酞可能通過其多重作用機制升高了BDNF的表達,并通過BDNF的神經(jīng)元保護作用增強了膽堿能系統(tǒng)的功能。 5. HSYA可提高VaD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力,但作用與多奈哌齊比較弱,且差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HSYA可提高海馬區(qū)CHAT、ACHE、VACHT的蛋白及mRNA表達,輕度降低VEGF的表達。HSYA對VEGF的調(diào)節(jié)作用提示HSYA除通過改善大腦供血供氧的作用機制外,還可能通過減輕炎癥損傷而保護了海馬膽堿能神經(jīng)元。 6.FTY720可提高VaD大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,但作用比多奈哌齊差,有統(tǒng)計學(xué)意義。FTY720可上調(diào)VaD大鼠海馬區(qū)CHAT、ACHE、VACHT、BDNF的蛋白及mRNA表達,輕度下調(diào)VEGF。提示FTY720作為免疫調(diào)節(jié)劑可以減輕缺血性疾病的炎癥損傷,并增加BDNF的表達,從而保護了膽堿能神經(jīng)元,進而改善了VaD大鼠的認知功能。 7.本研究從改善大腦供血、保護線粒體、抗炎性損傷等VaD的多方面作用機制出發(fā),選擇上述作用機制經(jīng)多項研究證實已經(jīng)較明確的三種藥物HYSA、NBP、 FTY720。結(jié)果顯示該三種藥物對VaD的學(xué)習(xí)記憶能力、以及膽堿能系統(tǒng)的損傷均有不同程度的改善。提示,對VaD應(yīng)采取多角度、多靶點的方式進行治療。
【關(guān)鍵詞】：血管性癡呆 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 乙酰膽堿酯酶 囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運體 腦源性神經(jīng)生長因子
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.1
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-15
• 前言15-20
• 研究現(xiàn)狀、成果15-18
• 研究目的、方法18-20
• 一、血管性癡呆大鼠模型建立及其空間記憶和海馬CHAT、AchE、VACHT蛋白表達的變化20-36
• 1.1 對象和方法20-27
• 1.1.1 實驗動物20
• 1.1.2 主要儀器20
• 1.1.3 主要試劑及耗材20-21
• 1.1.4 實驗試劑配置方法21
• 1.1.5 實驗方法21-27
• 1.2 結(jié)果27-31
• 1.2.1 水迷宮實驗27-28
• 1.2.2 western blot檢測海馬區(qū)CHAT、AchE、VACHT蛋白表達28
• 1.2.3 海馬CA]區(qū)HE染色28-29
• 1.2.4 免疫熒光染色檢測海馬CA1區(qū)CHAT、AchE、VACHT蛋白表達29-31
• 1.3 討論31-35
• 1.3.1 VaD大鼠模型與膽堿能系統(tǒng)31
• 1.3.2 VaD的研究發(fā)展以及VCI概念的提出31-32
• 1.3.3 VaD發(fā)病機制的研究32-35
• 1.4 小結(jié)35-36
• 二、丁苯肽、紅花黃色素、FTY720對VaD大鼠空間記憶、海馬CHAT、AChE、VAChT、VEGF、BDNF蛋白表達的影響36-63
• 2.1 對象和方法36-43
• 2.1.1 主要儀器36
• 2.1.2 主要試劑及耗材36-37
• 2.1.3 實驗試劑配置方法37-39
• 2.1.4 實驗方法39-43
• 2.2 結(jié)果43-53
• 2.2.1 水迷宮實驗43-44
• 2.2.2 western blot檢測海馬區(qū)VEGF、BDNF、CHAT、Ache、VACHT蛋白表達44-45
• 2.2.3 Real Time PCR檢測VEGF、BDNF、CHAT、ACHE、VACHT的mRNA表達45-46
• 2.2.4 海馬CA1區(qū)HE染色46-47
• 2.2.5 免疫組化染色47-49
• 2.2.6 免疫熒光染色49-53
• 2.3 討論53-62
• 2.3.1 神經(jīng)營養(yǎng)因子53-57
• 2.3.2 VaD的治療57-62
• 2.4 小結(jié)62-63
• 全文結(jié)論63-64
• 論文創(chuàng)新點64-65
• 參考文獻65-76
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明76-77
• 綜述77-87
• 綜述參考文獻81-87
• 致謝87

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 張莉莉,王景周,劉文生,陳曼娥;血管性癡呆大鼠腦中生長抑素和乙酰膽堿含量的變化[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2004年08期

2 于曉虹,華仲慰,李玉書;神經(jīng)生長因子對低氧缺血新生鼠紋狀體內(nèi)膽堿能神經(jīng)元的保護作用[J];生理學(xué)報;1993年04期

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本文編號：711996