本文關(guān)鍵詞：通過16S rRNA序列分析探討抑郁癥與腸道菌群之間的相互聯(lián)系

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【摘要】：背景抑郁癥是一種基因與環(huán)境相互作用的復(fù)雜精神疾病,嚴(yán)重危及人類健康;其患病率達(dá)15%,占全球疾病負(fù)擔(dān)的12.3%。WHO預(yù)測到2020年,抑郁癥將成為危害人類健康的第二大疾病。因此,加強抑郁癥預(yù)防、治療以及發(fā)病機制的研究迫在眉睫。抑郁癥發(fā)病機制學(xué)說眾多,主要聚焦于腦內(nèi)分子異常學(xué)說,包括神經(jīng)傳遞缺乏、神經(jīng)營養(yǎng)障礙、內(nèi)分泌免疫以及神經(jīng)解剖學(xué)等的異常。這些腦內(nèi)異常學(xué)說為揭示抑郁癥的病因提供了一定的理論依據(jù),但大都只能解釋某些方面的原因。例如,臨床基于腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失衡學(xué)說而開展的抗抑郁治療僅能使40%病人癥狀緩解。據(jù)此可見,抑郁癥發(fā)病機制中腦內(nèi)因素固然重要,但外環(huán)境因素及其作用機制更亟待闡明。人體內(nèi)腸道微生物細(xì)胞的數(shù)量是人體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的9倍,其基因總量約是人自身基因數(shù)目的150倍。因此,腸道微生物被認(rèn)為是人體最大、最直接的外環(huán)境,對維持人體健康發(fā)揮著重要作用。新近研究表明,腸道微生物能通過“微生物-腸-腦”軸來影響大腦神經(jīng)神經(jīng)生化和行為表型。課題組前期抑郁癥代謝組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者伴有腸道微生物源的代謝物(例如馬尿酸鹽,二甲胺和二甲基甘氨酸)紊亂,提示腸道微生物紊亂可能是抑郁癥的一個重要特征,亟待闡明。目的采用16srrna基因測序方法,通過比較58例抑郁癥患者和63例健康對照組的糞便中腸道微生物的構(gòu)成,評估抑郁癥患者中腸道微生物是否發(fā)生了顯著性的改變,其紊亂的關(guān)鍵腸道微生物是什么,為深入研究腸道微生物與抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵奠定基礎(chǔ)。方法1、研究對象依照結(jié)構(gòu)化精神病學(xué)指南我們采用了dsm-iv--tr標(biāo)準(zhǔn)進行抑郁癥的診斷以及17項漢密爾頓抑郁評分量表(hdrs)來用于量化抑郁癥的嚴(yán)重性。共納入58名抑郁癥患者和63名匹配的健康正常對照。在納入的抑郁患者中,大多數(shù)(n=39)為未用藥抑郁患者,其余(n=19)正服用各種抗抑郁藥物。2、標(biāo)本的收集和dna提取從所招募的受試者中收集糞便標(biāo)本后,迅速將標(biāo)本冰凍并保存在-80℃冰箱內(nèi),便于后續(xù)實驗。在液態(tài)氮中用研缽和杵將糞便樣品粉碎,用標(biāo)準(zhǔn)的dna提取試劑盒獲得細(xì)菌基因組dna。3、16srrna基因測序羅氏454測序:將提取的16srrna基因中的v3-v5區(qū)域片段利用通用引物進行pcr擴增。4、16srrna基因序列分析從454測序獲得的原始序列使用mothur版本1.31.2(http://www.mothur.org/)進行質(zhì)量篩選獲得獨特的讀取片段。不到200bp序列和大于1000bp序列以及含有引物錯配,條形不匹配,模棱兩可的堿基序列,均聚物運行超過6個基地的序列均被排除在外。剩余所有序列按照97%閾值以成對匹配的方式分配到操作分類單元(otus),使用rdp參考數(shù)據(jù)庫(http://www.mothur.org/wiki/rdp_reference_files)進行分類。這些分類法通過總結(jié)各個操作分類單元(otus)的分布,可用于計算不同級別的菌群的相對豐度。菌群的α多樣性采用四種不同的參數(shù)進行計算(i)觀察物種;(ii)shannon多樣性指數(shù);(iii)系統(tǒng)發(fā)育多樣性;(iv)simpson。β多樣性即樣本之間的距離多樣性,根據(jù)主坐標(biāo)分析(pcoa)基于加權(quán)和非加權(quán)(未加權(quán)的unifrac)算法。執(zhí)行unifrac分析時,使用pynast代表每個otu序列是一致的,從這種一致的系統(tǒng)建成發(fā)育樹。隨機森林算法是通過評估每個otu偏離預(yù)測值的誤差增長程度來給每個otu分配一個重要的分?jǐn)?shù),我們采用這種算法來鑒定出關(guān)鍵性的otu。結(jié)果1、以16s核糖體rna基因序列為基礎(chǔ)的測序方法,用來比較mdd患者和健康對照組的腸道微生物群落。從他們的糞便樣本中提取dna,我們共獲得854639個高質(zhì)量的16srrna基因序列(7063±2352讀取/糞便樣本),隨后在97%的相似性水平上被分為操作分類單元(otus)。這些otus多數(shù)屬于兩門菌種(厚壁菌門和擬桿菌門;83.1%±11.9%)。2、菌群的α多樣性表明兩組之間無顯著性差異;而進一步研究表明腸道菌群的β多樣性(加權(quán)unifrac分析)即微生物系統(tǒng)發(fā)育的相似程度在mdd與健康人之間存在著不同。未加權(quán)的unifrac分析三維圖顯示在mdd患者和健康對照組之間腸道微生物群落有明顯的差異。利用加權(quán)unifrac分析也觀察到抑郁癥患者和健康對照組之間的類似的區(qū)別�；祀s因素,包括分類變量(例如,性別、吸煙狀態(tài)和抗抑郁藥的使用)與連續(xù)變量(年齡、體重指數(shù))未顯著影響腸道微生物的表型。3、采用隨機森林,共鑒定出54個otus,其相對豐度能夠可靠的鑒別抑郁癥和健康對照的樣本。在這54個otus中,有29個otus的豐度在抑郁癥患者中高表達(dá),主要歸屬于:放線菌亞目,棒狀桿菌,乳酸桿菌,鏈球菌,梭菌xi(parvimonas),優(yōu)桿菌,毛螺旋菌(anaerostipes,blautia,dorea,lachnospiraceaincertaesedis),疣微菌科(梭菌屬iv),erysipelotrichaceaeincertaesedis;有25個otus的豐度在正常人中高表達(dá),主要歸屬于:擬桿菌,理炎菌(alistipes),毛螺旋菌(coprococcus,clostridiumxlva,lachnospiraceaincertaesedis,roseburia,andfaecalibacterium),氨基酸球菌(考拉桿菌),韋榮球菌(巨單胞菌)和sutterellaceae。在門的水平,這些顯著差異的otus主要集中在厚壁菌(45/56,76.7%),放線菌(5/56,10.9%)和擬桿菌(3/56,5.3%)。與健康對照組相比,抑郁癥患者的放線菌的相對豐度增加,而擬桿菌的相對豐富減少。雖然厚壁菌在抑郁癥患者和健康對照組中總體相對豐度沒有明顯差異,但是仍是抑郁癥中標(biāo)志性改變的腸道微生物。這是因為厚壁菌中的一些OTUs的豐度(24/56)在抑郁患者中高表達(dá),而其他OTUs在抑郁患者中則表達(dá)降低。綜上,我們發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者伴有顯著的腸道菌群的紊亂,而這些失調(diào)的微生物主要集中在厚壁菌,放線菌,擬桿菌這三種細(xì)菌。結(jié)論在抑郁癥患者與健康正常人中,腸道微生物群的構(gòu)成存在著顯著的改變和差異。與健康對照組相比,放線菌的相對豐度在抑郁癥患者中的表達(dá)增加,而擬桿菌的表達(dá)減少。此外,我們還發(fā)現(xiàn),厚壁菌也能鑒別抑郁癥患者和健康對照組,雖然整體的厚壁菌并沒有在兩組之間的相對豐度中發(fā)現(xiàn)顯著差異。我們的研究采用高同質(zhì)性的臨床生物樣本,率先提供了抑郁癥伴有腸道微生物紊亂的直接證據(jù),為下一步深入研究腸道微生物在抑郁癥發(fā)生中的作用奠定了基礎(chǔ),為解析抑郁癥的新發(fā)病機制提供一個全新的切入點。
【關(guān)鍵詞】：腸道菌群 抑郁癥 16S rRNA基因測序
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R749.4
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-5
• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-16
• 前言16-17
• 1 材料與方法17-23
• 2 結(jié)果23-32
• 3 討論32-34
• 全文總結(jié)34-35
• 參考文獻35-38
• 文獻綜述38-50
• 參考文獻44-50
• 致謝50-51
• 碩士期間發(fā)表論文51

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本文編號：650574