本文關(guān)鍵詞：通過16S rRNA序列分析探討抑郁癥與腸道菌群之間的相互聯(lián)系

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【摘要】：背景抑郁癥是一種基因與環(huán)境相互作用的復(fù)雜精神疾病,嚴(yán)重危及人類健康;其患病率達(dá)15%,占全球疾病負(fù)擔(dān)的12.3%。WHO預(yù)測(cè)到2020年,抑郁癥將成為危害人類健康的第二大疾病。因此,加強(qiáng)抑郁癥預(yù)防、治療以及發(fā)病機(jī)制的研究迫在眉睫。抑郁癥發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)眾多,主要聚焦于腦內(nèi)分子異常學(xué)說(shuō),包括神經(jīng)傳遞缺乏、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)障礙、內(nèi)分泌免疫以及神經(jīng)解剖學(xué)等的異常。這些腦內(nèi)異常學(xué)說(shuō)為揭示抑郁癥的病因提供了一定的理論依據(jù),但大都只能解釋某些方面的原因。例如,臨床基于腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失衡學(xué)說(shuō)而開展的抗抑郁治療僅能使40%病人癥狀緩解。據(jù)此可見,抑郁癥發(fā)病機(jī)制中腦內(nèi)因素固然重要,但外環(huán)境因素及其作用機(jī)制更亟待闡明。人體內(nèi)腸道微生物細(xì)胞的數(shù)量是人體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的9倍,其基因總量約是人自身基因數(shù)目的150倍。因此,腸道微生物被認(rèn)為是人體最大、最直接的外環(huán)境,對(duì)維持人體健康發(fā)揮著重要作用。新近研究表明,腸道微生物能通過“微生物-腸-腦”軸來(lái)影響大腦神經(jīng)神經(jīng)生化和行為表型。課題組前期抑郁癥代謝組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者伴有腸道微生物源的代謝物(例如馬尿酸鹽,二甲胺和二甲基甘氨酸)紊亂,提示腸道微生物紊亂可能是抑郁癥的一個(gè)重要特征,亟待闡明。目的采用16srrna基因測(cè)序方法,通過比較58例抑郁癥患者和63例健康對(duì)照組的糞便中腸道微生物的構(gòu)成,評(píng)估抑郁癥患者中腸道微生物是否發(fā)生了顯著性的改變,其紊亂的關(guān)鍵腸道微生物是什么,為深入研究腸道微生物與抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵奠定基礎(chǔ)。方法1、研究對(duì)象依照結(jié)構(gòu)化精神病學(xué)指南我們采用了dsm-iv--tr標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抑郁癥的診斷以及17項(xiàng)漢密爾頓抑郁評(píng)分量表(hdrs)來(lái)用于量化抑郁癥的嚴(yán)重性。共納入58名抑郁癥患者和63名匹配的健康正常對(duì)照。在納入的抑郁患者中,大多數(shù)(n=39)為未用藥抑郁患者,其余(n=19)正服用各種抗抑郁藥物。2、標(biāo)本的收集和dna提取從所招募的受試者中收集糞便標(biāo)本后,迅速將標(biāo)本冰凍并保存在-80℃冰箱內(nèi),便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在液態(tài)氮中用研缽和杵將糞便樣品粉碎,用標(biāo)準(zhǔn)的dna提取試劑盒獲得細(xì)菌基因組dna。3、16srrna基因測(cè)序羅氏454測(cè)序:將提取的16srrna基因中的v3-v5區(qū)域片段利用通用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。4、16srrna基因序列分析從454測(cè)序獲得的原始序列使用mothur版本1.31.2(http://www.mothur.org/)進(jìn)行質(zhì)量篩選獲得獨(dú)特的讀取片段。不到200bp序列和大于1000bp序列以及含有引物錯(cuò)配,條形不匹配,模棱兩可的堿基序列,均聚物運(yùn)行超過6個(gè)基地的序列均被排除在外。剩余所有序列按照97%閾值以成對(duì)匹配的方式分配到操作分類單元(otus),使用rdp參考數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mothur.org/wiki/rdp_reference_files)進(jìn)行分類。這些分類法通過總結(jié)各個(gè)操作分類單元(otus)的分布,可用于計(jì)算不同級(jí)別的菌群的相對(duì)豐度。菌群的α多樣性采用四種不同的參數(shù)進(jìn)行計(jì)算(i)觀察物種;(ii)shannon多樣性指數(shù);(iii)系統(tǒng)發(fā)育多樣性;(iv)simpson。β多樣性即樣本之間的距離多樣性,根據(jù)主坐標(biāo)分析(pcoa)基于加權(quán)和非加權(quán)(未加權(quán)的unifrac)算法。執(zhí)行unifrac分析時(shí),使用pynast代表每個(gè)otu序列是一致的,從這種一致的系統(tǒng)建成發(fā)育樹。隨機(jī)森林算法是通過評(píng)估每個(gè)otu偏離預(yù)測(cè)值的誤差增長(zhǎng)程度來(lái)給每個(gè)otu分配一個(gè)重要的分?jǐn)?shù),我們采用這種算法來(lái)鑒定出關(guān)鍵性的otu。結(jié)果1、以16s核糖體rna基因序列為基礎(chǔ)的測(cè)序方法,用來(lái)比較mdd患者和健康對(duì)照組的腸道微生物群落。從他們的糞便樣本中提取dna,我們共獲得854639個(gè)高質(zhì)量的16srrna基因序列(7063±2352讀取/糞便樣本),隨后在97%的相似性水平上被分為操作分類單元(otus)。這些otus多數(shù)屬于兩門菌種(厚壁菌門和擬桿菌門;83.1%±11.9%)。2、菌群的α多樣性表明兩組之間無(wú)顯著性差異;而進(jìn)一步研究表明腸道菌群的β多樣性(加權(quán)unifrac分析)即微生物系統(tǒng)發(fā)育的相似程度在mdd與健康人之間存在著不同。未加權(quán)的unifrac分析三維圖顯示在mdd患者和健康對(duì)照組之間腸道微生物群落有明顯的差異。利用加權(quán)unifrac分析也觀察到抑郁癥患者和健康對(duì)照組之間的類似的區(qū)別�；祀s因素,包括分類變量(例如,性別、吸煙狀態(tài)和抗抑郁藥的使用)與連續(xù)變量(年齡、體重指數(shù))未顯著影響腸道微生物的表型。3、采用隨機(jī)森林,共鑒定出54個(gè)otus,其相對(duì)豐度能夠可靠的鑒別抑郁癥和健康對(duì)照的樣本。在這54個(gè)otus中,有29個(gè)otus的豐度在抑郁癥患者中高表達(dá),主要?dú)w屬于:放線菌亞目,棒狀桿菌,乳酸桿菌,鏈球菌,梭菌xi(parvimonas),優(yōu)桿菌,毛螺旋菌(anaerostipes,blautia,dorea,lachnospiraceaincertaesedis),疣微菌科(梭菌屬iv),erysipelotrichaceaeincertaesedis;有25個(gè)otus的豐度在正常人中高表達(dá),主要?dú)w屬于:擬桿菌,理炎菌(alistipes),毛螺旋菌(coprococcus,clostridiumxlva,lachnospiraceaincertaesedis,roseburia,andfaecalibacterium),氨基酸球菌(考拉桿菌),韋榮球菌(巨單胞菌)和sutterellaceae。在門的水平,這些顯著差異的otus主要集中在厚壁菌(45/56,76.7%),放線菌(5/56,10.9%)和擬桿菌(3/56,5.3%)。與健康對(duì)照組相比,抑郁癥患者的放線菌的相對(duì)豐度增加,而擬桿菌的相對(duì)豐富減少。雖然厚壁菌在抑郁癥患者和健康對(duì)照組中總體相對(duì)豐度沒有明顯差異,但是仍是抑郁癥中標(biāo)志性改變的腸道微生物。這是因?yàn)楹癖诰械囊恍㎡TUs的豐度(24/56)在抑郁患者中高表達(dá),而其他OTUs在抑郁患者中則表達(dá)降低。綜上,我們發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者伴有顯著的腸道菌群的紊亂,而這些失調(diào)的微生物主要集中在厚壁菌,放線菌,擬桿菌這三種細(xì)菌。結(jié)論在抑郁癥患者與健康正常人中,腸道微生物群的構(gòu)成存在著顯著的改變和差異。與健康對(duì)照組相比,放線菌的相對(duì)豐度在抑郁癥患者中的表達(dá)增加,而擬桿菌的表達(dá)減少。此外,我們還發(fā)現(xiàn),厚壁菌也能鑒別抑郁癥患者和健康對(duì)照組,雖然整體的厚壁菌并沒有在兩組之間的相對(duì)豐度中發(fā)現(xiàn)顯著差異。我們的研究采用高同質(zhì)性的臨床生物樣本,率先提供了抑郁癥伴有腸道微生物紊亂的直接證據(jù),為下一步深入研究腸道微生物在抑郁癥發(fā)生中的作用奠定了基礎(chǔ),為解析抑郁癥的新發(fā)病機(jī)制提供一個(gè)全新的切入點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：腸道菌群 抑郁癥 16S rRNA基因測(cè)序
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.4
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照4-5
• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-16
• 前言16-17
• 1 材料與方法17-23
• 2 結(jié)果23-32
• 3 討論32-34
• 全文總結(jié)34-35
• 參考文獻(xiàn)35-38
• 文獻(xiàn)綜述38-50
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 致謝50-51
• 碩士期間發(fā)表論文51

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本文編號(hào)：650574