本文關(guān)鍵詞：RBM8a基因在胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和分化中的重要作用研究

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【摘要】：智力障礙(Intellectual Disability,ID)在神經(jīng)和精神疾病中十分常見,比如在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、自閉癥(Autism spectrum disorder,ASD)中十分常見。智力障礙的病人的智商(Intellectual Disability,IQ)往往較正常人低,小孩子伴有智力障礙者在學(xué)習(xí)語言、社會交往、自理能力方面較正常孩子緩慢。而自閉癥是一種以社會交往和溝通能力受損,重復(fù)的、刻板的行為學(xué)并常常伴有智力和認(rèn)知功能障礙為特征的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。無義介導(dǎo)的m RNA降解(Nonsense Mediated m RNA Decay,NMD軍控制RNA平衡和保證大量不必要的轉(zhuǎn)錄因子快速降解的一個RNA監(jiān)控機(jī)制。這個機(jī)制依賴于外顯子連接復(fù)合物(Exon Junction Complex,EJC)的多個核心因子:真核細(xì)胞翻譯起始因子4AIII(Eukaryotic Translation Initiation Factor 4AIII,e IF4AIII)、腫瘤易感候選基因3(Barentsz,BTZ)、人類同源果蠅Mago nashi蛋白(human homolog of Drosophila mago nashi protein,MAGOH)和核糖核酸結(jié)合基序蛋白8a(RNA-binding motif protein 8A,RBM8a)及其附近的一些因子來區(qū)分在正常轉(zhuǎn)錄的終止密碼子之前的非成熟終止密碼子(Premature Stop Codons,PTCs)。最近,研究表明無義介導(dǎo)的m RNA降解因子與神經(jīng)發(fā)育性障礙疾病比如自閉癥、精神分裂癥(Schizophrenia,SCZ)、智力障礙性疾病有聯(lián)系。有遺傳學(xué)研究揭示NMD在神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)再生、細(xì)胞增殖和分化等功能有重要的作用,然而,這些因子是如何控制大腦發(fā)育的機(jī)制尚不清楚。核糖核酸結(jié)合基序蛋白8a(RNA-binding motif protein 8A,RBM8a)是一個在m RNA剪接過程中與RNA結(jié)合的核蛋白,RBM8a調(diào)節(jié)的特異性調(diào)控細(xì)胞功能尤其在調(diào)控神經(jīng)祖細(xì)胞增殖、分化和大腦發(fā)育的功能尚未被完全明確。因此,本研究擬在檢測RBM8a基因在胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和分化的功能,以明確RBM8a基因在調(diào)控大腦發(fā)育的作用,為揭示RBM8a在神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病的病因?qū)W提供理論基礎(chǔ)。實驗內(nèi)容包括以下兩部分:第一部分:RBM8a基因在胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和分化中的作用目的檢測RBM8a在胚鼠不同階段和成年鼠之間的表達(dá)差異,在體外細(xì)胞系和胚鼠大腦中神經(jīng)祖細(xì)胞中過表達(dá)或沉默RBM8a,觀察細(xì)胞增殖和分化的改變,以明確RBM8a基因在胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和分化中的作用。方法將不同階段胚鼠和成年小鼠的大腦皮層組織分離、裂解并收集蛋白,使用western blot進(jìn)行檢測RBM8a的表達(dá)。分離14天胚鼠大腦中的神經(jīng)祖細(xì)胞,并在體外誘導(dǎo)其分化,觀察RBM8a的變化。收集16天胚鼠大腦并進(jìn)行固定、冰凍切片,檢測胚鼠大腦皮層RBM8a表達(dá)。構(gòu)建沉默RBM8a的sh RNA和過表達(dá)的RBM8a質(zhì)粒,并在CAD細(xì)胞系中證實其沉默和過表達(dá)的效果。在體外,分別用RBM8a的sh RNA和過表達(dá)的RBM8a質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CAD細(xì)胞,并使用Brd U標(biāo)記。在體內(nèi),利用子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)移技術(shù),將sh RNA和過表達(dá)RBM8a轉(zhuǎn)移到14天的胚鼠大腦皮層的神經(jīng)祖細(xì)胞內(nèi),并用Brd U標(biāo)記,以觀察RBM8a調(diào)控神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、分化和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。結(jié)果1.RBM8a在胚胎早期神經(jīng)祖細(xì)胞增殖的時候,RBM8a的表達(dá)水平很高,而當(dāng)胚鼠逐漸發(fā)育,神經(jīng)祖細(xì)胞分化的時候,RBM8a的表達(dá)水平亦隨之降低。2.在體外,當(dāng)神經(jīng)祖細(xì)胞分化的時候,RBM8a的水平明顯降低。在16天胚鼠大腦皮質(zhì)的室管膜層和室管膜下層,RBM8a與巢蛋白陽性的神經(jīng)祖細(xì)胞中大量表達(dá),而在雙腎上腺皮質(zhì)激素陽性的遷移神經(jīng)細(xì)胞和不成熟神經(jīng)元聚集的中間層和皮質(zhì)外層RBM8a表達(dá)明顯減少。RBM8a在CAD細(xì)胞被沉默后細(xì)胞分裂指數(shù)明顯降低,細(xì)胞增殖減少,而過表達(dá)RBM8a后,CAD細(xì)胞分裂指數(shù)明顯升高,促進(jìn)細(xì)胞增殖。3.在動物腎RBM8a可見以神經(jīng)祖細(xì)胞為主室管膜層和室管膜下層的細(xì)胞減少,而增加了進(jìn)入分化的神經(jīng)元所在的中間層和皮質(zhì)外層;相反,過表達(dá)胚鼠大腦皮質(zhì)中的RBM8a后,轉(zhuǎn)移至中外層的細(xì)胞減少而在室管膜層和室管膜下層的細(xì)胞增多,表明RBM8a正性調(diào)節(jié)神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖。4.在動物腎RBM8a時,細(xì)胞周期退出指數(shù)增加32%,導(dǎo)致神經(jīng)祖細(xì)胞的減少,而分化成新生神經(jīng)元增多;相反,過表達(dá)RBM8a后,細(xì)胞周期退出指數(shù)減少30%,導(dǎo)致神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖并抑制神經(jīng)祖細(xì)胞分化成新生的神經(jīng)元。結(jié)論RBM8a基因在調(diào)節(jié)早期神經(jīng)發(fā)育扮演著重要作用;RBM8a促進(jìn)胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和抑制神經(jīng)元的分化;RBM8a在維持神經(jīng)祖細(xì)胞增殖與分化的平衡中起重要作用。第二部分:基于RNA-seq技術(shù)對RBM8a調(diào)控的基因和信號通路分析目的通過以RNA-seq技術(shù)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,識別大腦中RBM8a可能調(diào)控的神經(jīng)精神疾病相關(guān)的下游基因和信號傳導(dǎo)通路。方法構(gòu)建過表達(dá)RBM8a質(zhì)粒p TRIPZ-m Cherry-RBM8a和對照質(zhì)粒p TRIPZm Cherry,將它們包裝慢病毒載體,構(gòu)建過表達(dá)RBM8a的SH-SY5Y穩(wěn)定細(xì)胞系,利用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)過表達(dá)RBM8a在細(xì)胞系中表達(dá),利用TRIzol試劑提取總RNA,使用Ribo Zero試劑盒選擇性的去除r RNA。使用Illumina Hi-Seq2500平臺,進(jìn)行高通量RNA測序,使用軟件工具分析過表達(dá)RBM8a與對照組之間有顯著差異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。將有差異性表達(dá)的基因列表與現(xiàn)有的不同的神經(jīng)精神疾病數(shù)據(jù)庫中高�；蛳嗷φ�,識別出他們之間重疊的基因,并進(jìn)一步使用western blot在CAD細(xì)胞中驗證RNA-seq有差異表達(dá)的基因的蛋白表達(dá)是否一致。利用DAVID生物信息分析軟件,分析RBM8a下游有差異表達(dá)的基因可能參與調(diào)控的信號傳導(dǎo)通路。最后分析本研究中有差異表達(dá)的基因是否導(dǎo)致有差別的選擇性剪接,是否有通過NMD調(diào)控的靶點基因。結(jié)果1.成功構(gòu)建過表達(dá)RBM8a質(zhì)粒,提取總RNA并取出r RNA后,利用高通量RNA測序和分析,最終過表達(dá)RBM8a組和對照組的m RNA測序,超過95%的閱讀都被映射到參考基因組。2.通過分析發(fā)現(xiàn),過表達(dá)RBM8a后有7.08%的轉(zhuǎn)錄因子相對于對照組有差異。過表達(dá)RBM8a的眾多下游基因與智力障礙、阿爾茨海默病、自閉癥、精神分裂癥數(shù)據(jù)庫中的高�；蛑睾�。自閉癥高危蛋白(NLGN1列,退行性神經(jīng)疾病蛋白(ATXN1列,神經(jīng)再生蛋白(REST逐,胚胎發(fā)育(TLE4軍脈移蛋白(KIF1A軍RBM8a過表達(dá)CAD細(xì)胞中表達(dá)與RNA測序結(jié)果一致,而沉默RBM8a的CAD細(xì)胞中表達(dá)與RNA測序結(jié)果相反。3.DAVID生物信息工具分析結(jié)果提示RBM8a調(diào)控了包括絲裂學(xué)激促酶/MAP激酶等信號傳導(dǎo)通路、生長因子信號傳導(dǎo)通路、Rho信號傳導(dǎo)通路、包含整合素和膠A傾覽丁傳導(dǎo)通路中的許多重要基因。4.本研究中371個選擇性剪接事件中有101蛋白編碼基因有顯著性差異,這些選擇性剪接的基因中許多與自閉癥(Autism spectrum disorder,ASD)的高危基因相重疊,與ASD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。5.在有差異表達(dá)的1788個基因中有814個基因表明與NMD有關(guān)聯(lián),它們分別與ASD、SCZ、AD和ID的高�；蛑睾�。結(jié)論無偏倚的RNA測序分析揭示了RBM8a調(diào)控著與許多退行性神經(jīng)疾病、精神疾病密切相關(guān)的高�；蚝驮缙谏窠�(jīng)發(fā)育的重要過程。
【關(guān)鍵詞】：RBM8a 外顯子連接復(fù)合物 神經(jīng)發(fā)育 神經(jīng)祖細(xì)胞 智力障礙 RBM8a RNA高通量測序 神經(jīng)發(fā)育 轉(zhuǎn)錄組學(xué) 無義介導(dǎo)的信使RNA降解
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R749
【目錄】：

• 個人簡歷3-5
• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-16
• 前言16-19
• 第一部分 RBM8a基因在胚胎神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和分化中的作用19-55
• 1. 實驗材料與方法19-38
• 2.結(jié)果38-53
• 3.討論53-54
• 4 小結(jié)54-55
• 第二部分 基于RNA-seq技術(shù)對RBM8a調(diào)控的基因和信號通路分析55-87
• 1 實驗材料與方法55-67
• 2 結(jié)果67-84
• 3 討論84-86
• 4 小結(jié)86-87
• 結(jié)論87-88
• 參考文獻(xiàn)88-99
• 綜述99-121
• 參考文獻(xiàn)110-121
• 英漢縮略語名詞對照121-122
• 致謝122-124
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文124-126

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本文編號：650748