本文關(guān)鍵詞：星形膠質(zhì)細胞溶酶體與β-淀粉樣蛋白的相互作用機制研究

  更多相關(guān)文章： Aβ 星形膠質(zhì)細胞 溶酶體 Forskolin

【摘要】：目的:1.研究Aβ處理對星形膠質(zhì)細胞溶酶體的p H、體積及數(shù)目的變化,闡明Aβ對星形膠質(zhì)細胞溶酶體功能的影響。2.用bafilomycin A1抑制質(zhì)子泵,觀察溶酶體pH、數(shù)目變化及溶酶體對外源性Aβ降解的影響。3.研究用NH4Cl處理星形膠質(zhì)細胞后觀察其對外源性Aβ降解的影響。4.研究forskolin對星形膠質(zhì)細胞溶酶體的p H、體積及數(shù)目的變化,明確forskolin對星形膠質(zhì)細胞溶酶體功能的影響。5.闡明forskolin處理對溶酶體降解Aβ的影響。6.研究forskolin處理對細胞內(nèi)總Aβ含量的影響,闡明forskolin對星形膠質(zhì)細胞Aβ含量的影響。方法:取新生1~3天小鼠的大腦皮層,進行原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)。純化后用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)的單克隆抗體標記細胞骨架,鑒定培養(yǎng)的細胞為星形膠質(zhì)細胞。將活細胞用DND-99標記以便于動態(tài)觀察溶酶體變化。用200 nM的Aβ42孵育細胞30 min后,給予細胞250 nM的bafilomycin A1處理30 min(或用200μM的forskolin處理45 min),1μM的DND-99孵育30 min,活細胞成像觀察溶酶體的p H、體積及數(shù)目的變化。用200 nM帶綠色熒光標記的Aβ42孵育細胞30 min后,分別給予250 nM的bafilomycin A1和25mM的NH4Cl處理30 min(或用200μM的forskolin處理45 min),活細胞成像觀察細胞內(nèi)Aβ含量的影響。用200 nM的Aβ42孵育細胞30 min后,用200μM的forskolin處理45 min,裂解細胞并用ELISA方法檢測內(nèi)源性Aβ42的含量。結(jié)果:1.外源性Aβ42經(jīng)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)吞后定位到溶酶體。2.Aβ42處理使細胞溶酶體pH降低、溶酶體體積變大以及溶酶體數(shù)目減少。3.細胞經(jīng)bafilomycin A1堿化以后,溶酶體數(shù)目減少;經(jīng)bafilomycin A1處理以后,內(nèi)吞的Aβ42在細胞內(nèi)聚集。4.細胞經(jīng)NH4Cl酸化以后,外源性Aβ42在細胞內(nèi)的聚集減少。5.Forskolin處理使細胞溶酶體p H降低、溶酶體體積變大以及溶酶體數(shù)目減少;Forskolin處理使外源性Aβ42在細胞內(nèi)聚集;Forskolin處理使內(nèi)源性Aβ42的量增加。結(jié)論:Aβ處理星形膠質(zhì)細胞30 min后定位到溶酶體。Aβ聚集在星形膠質(zhì)細胞溶酶體中損傷溶酶體正常功能,導(dǎo)致溶酶體數(shù)目減少。Forskolin處理與Aβ處理產(chǎn)生類似的效果,并促使外源性Aβ在溶酶體中的積累,最終導(dǎo)致溶酶體數(shù)目的減少。Forskolin導(dǎo)致溶酶體功能損傷的機制可能與其激活PKA信號通路,促使內(nèi)源性Aβ產(chǎn)生并積累到溶酶體有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：Aβ 星形膠質(zhì)細胞 溶酶體 Forskolin
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-13
• 1 實驗材料與方法13-21
• 1.1 實驗材料13-17
• 1.1.1 感受態(tài)細胞與質(zhì)粒13
• 1.1.2 抗生素13
• 1.1.3 實驗用試劑盒13
• 1.1.4 細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑13-14
• 1.1.5 細胞轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑14
• 1.1.6 細胞藥物處理14
• 1.1.7 常用溶液的配方14-16
• 1.1.8 主要抗體及熒光染料來源16
• 1.1.9 主要儀器設(shè)備16
• 1.1.10實驗動物16-17
• 1.2 實驗方法17-21
• 1.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與提取17
• 1.2.2 可溶性Aβ42的制備17
• 1.2.3 小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)17-18
• 1.2.4 小鼠星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染18
• 1.2.5 小鼠星形膠質(zhì)細胞免疫細胞化學(xué)18-19
• 1.2.6 ELISA檢測19
• 1.2.7 Aβ42和藥物處理19-20
• 1.2.8 共聚焦顯微圖像的獲取及分析20
• 1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計20-21
• 2 實驗結(jié)果21-32
• 2.1 星形膠質(zhì)細胞純化鑒定21
• 2.2 LysoTracker Red DND-99可以用于標記活細胞溶酶體21-22
• 2.3 星形膠質(zhì)細胞內(nèi)吞Aβ 后定位到溶酶體22-23
• 2.4 用不帶熒光的Aβ42處理，觀察溶酶體功能變化23-24
• 2.4.1 Aβ42處理后，溶酶體變酸23
• 2.4.2 Aβ42處理后，溶酶體體積變大、數(shù)目減少23-24
• 2.5 質(zhì)子泵抑制劑Bafilomycin A1使溶酶體數(shù)目減少24-26
• 2.6 Bafilomycin A1處理使Aβ 在細胞內(nèi)聚集，無法被溶酶體有效降解26
• 2.7 NH_4Cl處理加速Aβ 在細胞內(nèi)的降解26-27
• 2.8 Forskolin對星形膠質(zhì)細胞溶酶體功能的影響27-30
• 2.8.1 Forskolin使星形膠質(zhì)細胞溶酶體變酸27-28
• 2.8.2 Forskolin處理使星形膠質(zhì)細胞溶酶體體積變大、數(shù)目減少28-30
• 2.9 Forskolin處理細胞使外源性Aβ 在細胞內(nèi)聚集30-31
• 2.10 Forskolin處理細胞使內(nèi)源性Aβ 的產(chǎn)生增加31-32
• 3 討論32-36
• 4 結(jié)論36-37
• 參考文獻37-41
• 附錄A 文獻綜述41-52
• 參考文獻49-52
• 在學(xué)研究成果52-53
• 致謝53

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