本文關(guān)鍵詞：FP1在鉛導(dǎo)致PC12細胞內(nèi)鐵聚積中的作用研究

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【摘要】：研究目的： 因越來越多的研究發(fā)現(xiàn)鉛可以引起阿爾茲海默�。ˋlzheimer’s disease, AD），使得鉛的神經(jīng)毒性再次備受關(guān)注成為熱點問題之一，然而其機制仍未完全明了。在我們前期研究的長期鉛暴露動物模型中發(fā)現(xiàn)鉛可以引起老年大鼠腦鐵過載。眾所周知，腦鐵過載是阿爾茲海默病的病因。因此，我們有理由認為鉛引起鐵過載進而導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病。然而，鉛是通過何種途徑或機制引起腦鐵過載尚不清楚。故本研究建立體外培養(yǎng)的大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞系即PC12細胞鉛暴露模型，探討鉛暴露對細胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的影響及鐵轉(zhuǎn)入蛋白二價金屬離子轉(zhuǎn)運體（divalent metal transporter1, DMT1）和鐵轉(zhuǎn)出蛋白膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白（ferroportin1, FP1）在其中的作用。 實驗方法： （1）PC12細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在不同鐵環(huán)境下（正常鐵環(huán)境、10μM硫酸亞鐵、100μM去鐵胺）以濃度梯度（0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM）的醋酸鉛處理細胞24、48和72小時（h）后，使用鐵染色（Perl’s staining）檢測細胞內(nèi)鐵水平的變化，使用MTT法檢測細胞活力變化。 （2）濃度梯度（0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM）的醋酸鉛分別處理細胞24、48和72h后，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）檢測細胞DMT1和FP1mRNA表達水平的變化，使用免疫蛋白印跡法（western blotting, WB）檢測細胞DMT1和FP1蛋白表達水平的變化。 （3）用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染法將pFP1-EGFP-N1質(zhì)粒和pEGFP-N1空載轉(zhuǎn)入細胞，并通過觀察綠色熒光蛋白GFP陽性細胞和免疫熒光法（Immunofluorescent,IF）檢測FP1表達變化以評估轉(zhuǎn)染效果。 （4）細胞轉(zhuǎn)染后，再用10μM醋酸鉛處理24h，使用鐵染色（Perl’s staining）和鐵熒光檢測法（Iron fluorescence detection）檢測細胞內(nèi)鐵水平的變化。 實驗結(jié)果： （1）鉛暴露引起PC12細胞內(nèi)鐵含量增加：Perl’s鐵染色發(fā)現(xiàn)，鉛暴露后PC12細胞內(nèi)鐵水平增加，且隨著鉛暴露濃度和時間增加呈劑量反應(yīng)關(guān)系。高鐵環(huán)境能加重鉛引起的細胞內(nèi)鐵聚積。 （2）鉛暴露引起PC12細胞活力下降：MTT檢測顯示在鉛暴露24h后，PC12細胞活力在不同鐵環(huán)境下的各濃度鉛暴露組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；在鉛暴露48和72h后，PC12細胞活力下降，，且隨著鉛暴露濃度和時間的增加呈劑量反應(yīng)關(guān)系。此外，在高鐵環(huán)境下，這種劑量反應(yīng)下降表現(xiàn)更為嚴重。 （3）鉛暴露影響DMT1的表達：RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，DMT1(-IRE)表達水平僅在高濃度（100μM）鉛暴露24h后較對照組上升（P0.05）。DMT1(+IRE)mRNA表達水平在鉛暴露24h后，隨著鉛濃度增加呈現(xiàn)劑量反應(yīng)上升，而在鉛暴露48和72h后，隨著鉛濃度增加呈現(xiàn)劑量反應(yīng)下降（P0.05）。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，在鉛暴露24h后，PC12細胞DMT1蛋白表達水平增加，且隨著鉛暴露濃度增加呈劑量反應(yīng)關(guān)系。但隨著鉛暴露時間延長至72h后，PC12細胞DMT1蛋白表達水平降低，且隨著鉛暴露濃度增加呈劑量反應(yīng)關(guān)系。 （4）鉛暴露引起FP1的表達下降：RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，僅在鉛暴露72h后，PC12細胞FP1mRNA表達水平在10-100μM鉛暴露組較對照組降低（P0.05）。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，在鉛暴露24、48和72h后， PC12細胞內(nèi)FP1的蛋白表達水平降低，且隨著鉛暴露濃度和時間增加呈劑量反應(yīng)關(guān)系。 （5）FP1高表達減輕鉛暴露后細胞內(nèi)鐵聚積的程度：PC12細胞經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染FP1質(zhì)粒和空載后，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組FP1蛋白表達水平增加為空載轉(zhuǎn)染對照組的3.3倍（P0.05）。轉(zhuǎn)染后細胞用10μM醋酸鉛處理24h，Perl’s鐵染色發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)鐵水平是空載轉(zhuǎn)染對照組細胞內(nèi)鐵水平的0.4倍（P0.05）。鐵熒光檢測發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)鐵水平是空載轉(zhuǎn)染對照組細胞內(nèi)鐵水平的0.33倍（P0.05）。 結(jié)論: 鉛暴露引起PC12細胞內(nèi)鐵聚積是下調(diào)FP1表達水平所致，而可能與DMT1表達水平變化無關(guān)。故FP1可能成為阻止鉛引起神經(jīng)細胞鐵過載及隨后發(fā)展的神經(jīng)退行性變的新靶點。
【關(guān)鍵詞】：鉛 鐵 膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1 二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1 高表達
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 縮略詞表10-12
• 第1章 前言12-16
• 第2章 鉛暴露對 PC12 細胞活力及胞內(nèi)鐵水平的影響16-29
• 2.1 概述16
• 2.2 材料和方法16-24
• 2.2.1 材料16-21
• 2.2.2 方法21-24
• 2.3 結(jié)果24-26
• 2.3.1 Perl’s 染色檢測鉛暴露后 PC12 細胞內(nèi)鐵水平24-26
• 2.3.2 MTT 檢測鉛暴露后 PC12 細胞的活力26
• 2.4 討論26-28
• 2.5 小結(jié)28-29
• 第3章 鉛暴露對 PC12 細胞鐵轉(zhuǎn)運蛋白 DMT1 和 FP1 表達的影響29-47
• 3.1 概述29
• 3.2 材料和方法29-39
• 3.2.1 材料29-35
• 3.2.2 方法35-39
• 3.3 結(jié)果39-46
• 3.3.1 RT-PCR、WB 檢測鉛暴露 PC12 細胞 DMT1 表達變化39-43
• 3.3.2 RT-PCR、WB 檢測鉛暴露 PC12 細胞 FP1 表達變化43-46
• 3.4 討論46
• 3.5 小結(jié)46-47
• 第4章 FP1 高表達對鉛暴露的 PC12 細胞內(nèi)鐵聚積的影響47-60
• 4.1 概述47
• 4.2 材料和方法47-53
• 4.2.1 材料47-50
• 4.2.2 方法50-53
• 4.3 結(jié)果53-59
• 4.3.1 測序及跑膠鑒定 FP1 質(zhì)粒53-54
• 4.3.2 GFP 熒光表達檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果54-55
• 4.3.3 免疫熒光(IF)檢測轉(zhuǎn)染后目的蛋白表達量55-56
• 4.3.4 Perl’s 染色檢測 FP1 高表達對細胞內(nèi)鐵聚積影響56-57
• 4.3.5 鐵熒光檢測 FP1 高表達對細胞內(nèi)鐵聚積影響57-59
• 4.4 討論59
• 4.5 小結(jié)59-60
• 第5章 結(jié)論60-61
• 5.1 概述60
• 5.2 主要結(jié)論60
• 5.3 本課題創(chuàng)新之處60-61
• 致謝61-62
• 參考文獻62-68
• 附錄68-74
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果74-75
• 綜述75-81
• 參考文獻78-81

  本文關(guān)鍵詞：FP1在鉛導(dǎo)致PC12細胞內(nèi)鐵聚積中的作用研究

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本文編號：511531