本文關(guān)鍵詞：過表達(dá)Hsp75削弱小膠質(zhì)細(xì)胞可溶性因子對神經(jīng)干細(xì)胞毒性作用與機制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種以進行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為特征的神經(jīng)退行性疾病。其臨床表現(xiàn)為記憶力、抽象思維能力和語言功能的減退,情感和行為異常,喪失工作能力和獨立生活能力。目前臨床用于治療AD的藥物主要有作用于膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的藥物,其中多數(shù)為膽堿酯酶抑制劑。此外,還有N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體阻斷劑等。但是,這些藥物只能用來預(yù)防及緩解AD的發(fā)生及發(fā)展,并不能起到根治的作用。因此,尋求新的治療AD的方法成為了目前關(guān)注的焦點。近年來,干細(xì)胞技術(shù)不斷地完善與提高,給AD的治療帶來了曙光。但是,自從人們提出用神經(jīng)干細(xì)胞技術(shù)治療AD的構(gòu)想以來,無論是通過促進AD患者內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞生成還是通過外源性移植神經(jīng)干細(xì)胞治療AD都未取得明顯的進展,提示AD患者顱內(nèi)“微環(huán)境”的改變可能影響著腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的生存和功能的發(fā)揮。我們的前期研究已經(jīng)證實：AD患者顱內(nèi)“微環(huán)境”的改變與β-淀粉樣蛋白(Aβ)密切相關(guān),其能刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子及趨化因子導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞的失能。因此,尋求一種方法來削弱Aβ通過小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)干細(xì)胞造成的損害成為了本課題研究的主要目的。近年來,線粒體在AD的研究已經(jīng)成為了一個熱點；線粒體不僅為細(xì)胞提供能量,也參與了細(xì)胞凋亡和壞死的調(diào)控。我們的前期研究已經(jīng)證實,線粒體病變與AD存在著密切的關(guān)系,特別是AD顱內(nèi)環(huán)境中的炎性因子加劇了線粒體的損傷。大量研究證明：線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)在維持線粒體功能、調(diào)控細(xì)胞的凋亡和壞死中起著重要的作用。mPTP是一個橫跨于線粒體內(nèi)外膜由多種蛋白質(zhì)組成的非選擇性通道,在正常的生理情況下呈關(guān)閉的狀態(tài)或者低通透性的狀態(tài),僅分子量不超過1.5kDa的小分子物質(zhì)才能通過這一孔道；但是在異常的病理情況下,mPTP呈高通透狀性態(tài),會引起線粒體的腫脹和外膜的破裂,細(xì)胞色素C (cytochrome c, Cytc)等促凋亡物質(zhì)釋放入細(xì)胞漿中,激活caspase酶,最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和壞死,這一過程也稱線粒體依賴性凋亡途徑。目前,關(guān)于mPTP的確切成分存在著許多爭議,但是越來越多的研究認(rèn)為線粒體基質(zhì)內(nèi)親環(huán)素D(Clophilin D, CypD)是mPTP的主要成分,也是mPTP形成的啟動子；在外界相關(guān)刺激因素下,CypD介導(dǎo)了mPTP的形成與開放。熱休克蛋白75 (heat shock protein 75, Hsp75)也稱為腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1(tumor necrosis factor receptor associated protein 1),其主要定位于線粒體,是一種線粒體蛋白,屬于Hsp90家族的成員之一。既往研究已經(jīng)證實：Hsp75的合成受外界多種環(huán)境刺激的影響,包括低糖、缺血缺氧、紫外照射等。此外,Hsp75在維持線粒體功能和調(diào)控細(xì)胞的死亡也起著至關(guān)重要的作用,越來越多的研究表明：Hsp75是一個抗凋亡的蛋白,特別是在心肌細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中都已證實了其抗凋亡的作用；但是關(guān)于Hsp75在阿爾茨海默病中的作用及其機制,在國內(nèi)外的研究中還尚未報道�；谏鲜鲅芯�,本課題建立了一個Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng),將神經(jīng)干細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分別接種于共培養(yǎng)系統(tǒng)的下室和上室以觀察兩種細(xì)胞間非接觸性的相互作用。通過構(gòu)建攜帶Hsp75基因的腺病毒去感染神經(jīng)干細(xì)胞,使神經(jīng)干細(xì)胞過表達(dá)Hsp75蛋白,研究Hsp75蛋白在Aβ刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放可溶性介質(zhì)對神經(jīng)干細(xì)胞影響中的作用,并進一步從分子水平上去探討Hsp75蛋白是否通過CypD依賴的mPTP這一通路去調(diào)控細(xì)胞的功能。本研究成果豐富了AD發(fā)病機制的理論基礎(chǔ),也為今后AD的臨床治療提供了技術(shù)支持。方法1.重組腺病毒Ad-Hsp75-GFP的構(gòu)建利用PCR的方法擴增Hsp75基因,凝膠電泳鑒定；pHBAd-MCMV-GFP載體質(zhì)粒和目的基因Hsp75經(jīng)酶切、片段回收、連接后,獲得重組質(zhì)粒pHBAd-MCMV-Hsp75-GFP。通過酶切、測序鑒定后,將該重組質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,獲得重組腺病毒Ad-Hsp75-GFP,行PCR鑒定和TCID50法進行病毒滴度的測定。2.神經(jīng)干細(xì)胞C17.2和小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2的培養(yǎng)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清、5%馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,于37℃的5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2天換液1次,并于顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況。待細(xì)胞生長至占培養(yǎng)瓶底面積約80-90%時,棄去培養(yǎng)基,用PBS緩沖液洗兩次,加入1ml的胰酶消化細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞在鏡下呈收縮漸漸變圓時棄去胰酶,加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基吹打終止消化。吹打均勻后,用細(xì)胞計數(shù)板進行計數(shù)接種于新的培養(yǎng)瓶,于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),取第3-7代的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。BV-2細(xì)胞的培養(yǎng)方法與C17.2細(xì)胞的培養(yǎng)方法類似,只需將培養(yǎng)基換為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基即可。3.重組腺病毒感染C17.2神經(jīng)干細(xì)胞及相關(guān)檢測將C17.2細(xì)胞接種于6孔板(或96孔板),接種密度為2x105個/孔(或lx104個/孔),培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、5%馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng),12h后去除培養(yǎng)基,用PBS漂洗2次,添加感染復(fù)數(shù)為100的腺病毒液和1ml無血清DMEM高糖培養(yǎng)基,感染2h后棄去含病毒的培養(yǎng)基,用PBS漂洗2次,換2ml含10%胎牛血清、5%馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)36h后,進行如下相關(guān)檢測：(1)在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光的表達(dá)情況。(2)棄去培養(yǎng)基,用PBS漂洗2次,胰酶消化收集細(xì)胞,PBS重懸制細(xì)胞懸液,用流式細(xì)胞儀檢測腺病毒在C17.2細(xì)胞中的感染率。(3)于倒置相差顯微鏡下,觀察細(xì)胞感染前和感染后的形態(tài)。(4)對感染前后的神經(jīng)干細(xì)胞進行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測,采用神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗體nestin進行標(biāo)記,DAPI對細(xì)胞核進行復(fù)染,并于熒光顯微鏡下觀察。(5)對感染前后的神經(jīng)干細(xì)胞進行MTT的活性檢測,步驟如下：腺病毒感染36h后,棄去培養(yǎng)基,PBS漂洗3次,于每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl,37℃培養(yǎng)箱中避光孵育4 h,棄去上清液,加入150μl的二甲基亞砜(DMSO),震蕩混勻使結(jié)晶充分溶解,以酶標(biāo)儀490nm波長檢測OD值。(6)對感染前后的神經(jīng)干細(xì)胞行Western blot檢測：用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞,離心后取上清,BCA法測蛋白質(zhì)含量,10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,將蛋白半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上,封閉液封閉后,加入Hsp75多克隆抗體和β-actin小鼠單克隆抗體,之后用辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗結(jié)合,ECL法顯色后掃描。4.Aβ1-42多肽的準(zhǔn)備將Aβ1-42溶解于35%的乙腈中,使用PBS稀釋到儲存濃度10mM。將稀釋后的藥物放置于37℃的培養(yǎng)箱中老化48h,促進Aβ1-42的聚集和纖維化,置于-20℃的冰箱中保存；使用時用培養(yǎng)基稀釋到工作濃度10μM即可。5. Transwell共培養(yǎng)體系的構(gòu)建及分組(1)空白對照組(Control):C17.2細(xì)胞培養(yǎng)于下室,上室不接種BV-2細(xì)胞,用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。(2)Aβ1-42直接作用組(NSCs+Aβ1-42):C17.2細(xì)胞培養(yǎng)于下室并加入終濃度10μMAβ1-42的培養(yǎng)基。(3)共培養(yǎng)對照組(NSCs-MG):C17.2與BV-2以1：1的密度分別接種于共培養(yǎng)體系的下室和上室,用正常的培養(yǎng)基培養(yǎng)。(4)Aβ1-42作用的共培養(yǎng)組(NSCs-MG+Aβ1-42):C17.2與BV-2以1：1密度分別接種于共培養(yǎng)體系的下室和上室,培養(yǎng)體系為終濃度10 μM Aβ1-42的培養(yǎng)基(5)腺病毒陰性感染組(Ad-GFP+Aβ1-42):感染了陰性腺病毒的C17.2神經(jīng)干細(xì)胞與正常BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞以1：1的密度分別接種于共培養(yǎng)體系的下室和上室,培養(yǎng)體系為終濃度10μM Aβ1-42的培養(yǎng)基(6)腺病毒陽性感染組(Ad-Hsp75+Aβ1-42):感染了攜帶目的基因腺病毒的C17.2神經(jīng)干細(xì)胞與正常BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞以1：1的密度分別接種于共培養(yǎng)體系的下室和上室,培養(yǎng)體系為終濃度10μMAβ1-42的培養(yǎng)基。6.流式細(xì)胞儀分析神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡率按照各實驗分組的情況分別對各組施加處理因素后,收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗2次,然后用試劑盒專用的Binding buffer重懸細(xì)胞,加入5μl的Annexin V-APC,室溫避光孵育15min后再加入5μl的7-AAD試劑,上流式機檢測神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡率。7. TMRE染色法分析神經(jīng)干細(xì)胞線粒體的膜電位按照分組處理后,棄去培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS漂洗2次,加入終濃度為100nM的TMRE染液,37℃下避光孵育15min, PBS漂洗3次后,于熒光顯微鏡下拍照。8. Western blot檢測神經(jīng)干細(xì)胞中Hsp75、Cytc、CypD、Caspase-3蛋白的表達(dá)按照分組處理后,棄去培養(yǎng)基,收集各組細(xì)胞提取總蛋白,BCA進行蛋白定量,用Western blot方法檢測各組的Hsp75、CypD、Caspase-3、Cytc蛋白的表達(dá)水平。9. q-PCR檢測神經(jīng)干細(xì)胞中CypD、Caspase-3的mRNA表達(dá)按照分組處理后,棄去培養(yǎng)基,收集各組細(xì)胞提取總RNA,用q-PCR方法檢測各組CypD和Caspase-3的mRNA表達(dá)水平。10.統(tǒng)計學(xué)處理文章數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果均使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(X±SEM)表示,多組間的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。方差齊時采用最小顯著性差異法(LSD法)；方差不齊時則采用Dunnett's T3法。p0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.重組腺病毒Ad-Hsp75-GFP的成功構(gòu)建PCR擴增Hsp75基因后,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析顯示：在約2100bp處可見特異性片段。所獲的重組質(zhì)粒pHBAd-MCMV-Hsp75-GFP經(jīng)酶切鑒定顯示有2100bp和5300bp兩條帶,與預(yù)期結(jié)果一致；經(jīng)測序結(jié)果比對后,與目的序列完全匹配。然后,將該重組質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,獲得重組腺病毒Ad-Hsp75-GFP,行PCR鑒定可獲得與預(yù)期大小一致2100bp的片段。采用TCID50方法進行病毒滴度的測定,病毒的滴度可達(dá)1×1010　PFU/ml。2.重組腺病毒成功感染C17.2神經(jīng)干細(xì)胞重組腺病毒感染C17.2細(xì)胞,36h后,置于熒光顯微鏡下觀察,大部分細(xì)胞有綠色熒光蛋白的表達(dá)；經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,腺病毒感染C17.2細(xì)胞的感染率約為85%；在倒置相差顯微鏡下和熒光顯微鏡下觀察到,細(xì)胞感染前后其形態(tài)無明顯的改變,nestin表達(dá)也無明顯的改變；經(jīng)MTT檢測感染前后細(xì)胞的活性,表明感染前后細(xì)胞的活性無明顯的變化；此外,Western blot檢測結(jié)果表明：Ad-Hsp75-GFP組與正常組(Control)和腺病毒陰性感染組Ad-GFP相比,Hsp75蛋白表達(dá)量明顯增加(p0.05)。3.Hsp75蛋白表達(dá)隨著小膠質(zhì)細(xì)胞可溶性因子處理時間的延長而增加實驗中我們使用Ap1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放可溶性因子處理神經(jīng)干細(xì)胞,探討小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的可溶性因子對神經(jīng)干細(xì)胞Hsp75蛋白表達(dá)水平的影響,Aβ1-42處理時間分別為6h、12h、24h、36h、48h。我們發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比,Aβ1-42直接作用組的神經(jīng)干細(xì)胞Hsp75蛋白明顯增加(P0.05),然而共培養(yǎng)對照組并無顯著性的差異(P0.05)；Aβ1-42作用的共培養(yǎng)組與空白對照組相比,隨著Aβ1-42處理時間的增加Hsp75表達(dá)也逐漸增加,均具有顯著性意義(P0.05),但在48h時開始有所下降�；谏鲜龅膶嶒灲Y(jié)果選取36h作為后續(xù)實驗Aβ1-42處理的時間。4.Hsp75蛋白降低神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡率實驗中我們使用Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放可溶性因子處理神經(jīng)干細(xì)胞,探討Hsp75蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞釋放可溶性因子對神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率的影響,Aβ1-42處理時間為36h。我們發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比較,Aβ1-42直接作用組的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率顯著增加(P0.05),然而共培養(yǎng)對照組的凋亡率無明顯的變化(P0.05)；與空白對照組相比較,Aβ1-42作用的共培養(yǎng)組和腺病毒陰性感染組的凋亡率顯著增加,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),然而后兩組相比較并無顯著性意義(P0.05)；與Aβ1-42作用的共培養(yǎng)組和腺病毒陰性感染組相比較,腺病毒陽性感染組的干細(xì)胞凋亡率明顯下降,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。提示神經(jīng)干細(xì)胞過表達(dá)Hsp75蛋白能夠減弱Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放可溶性因子對其的神經(jīng)毒性。5.Hsp75蛋白保護神經(jīng)干細(xì)胞線粒體的膜電位實驗中我們使用Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放可溶性因子處理神經(jīng)干細(xì)胞,探討Hsp75蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞釋放可溶性因子對神經(jīng)干細(xì)胞線粒體膜電位的影響,Aβ1-42處理時間為36h。我們發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比較,Aβ1-42直接作用組的神經(jīng)干細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降(P0.05),然而共培養(yǎng)對照組的線粒體膜電位無明顯的變化(P0.05)；與空白對照組相比較,Aβ1-42作用的共培養(yǎng)組和腺病毒陰性感染組的線粒體膜電位顯著下降,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),然而后兩組相比較并無顯著性意義(P0.05)；與Aβ1-42作用的共培養(yǎng)組和腺病毒陰性感染組相比較,腺病毒陽性感染組的干細(xì)胞線粒體膜電位明顯逆轉(zhuǎn),膜電位顯著增高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。提示神經(jīng)干細(xì)胞過表達(dá)Hsp75蛋白能夠減輕Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放可溶性因子導(dǎo)致的線粒體膜電位丟失。6.Hsp75蛋白減弱神經(jīng)干細(xì)胞Cytc釋放和降低神經(jīng)干細(xì)胞CypD、Caspase-3的表達(dá)實驗中我們使用Aβ1-42刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放可溶性因子處理神經(jīng)干細(xì)胞,探討Hsp75蛋白能否削弱小膠質(zhì)細(xì)胞釋放可溶性因子導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞mPTP的開放及是否通過調(diào)節(jié)線粒體依賴的凋亡途徑發(fā)揮對神經(jīng)干細(xì)胞的保護作用,Aβ1-42處理時間為36h。從結(jié)果中我們可知：與空白對照組相比較,Aβ1-42直接作用組的Cytc蛋白釋放顯著增加(P0.05),然而共培養(yǎng)對照組的Cytc蛋白釋放無明顯的變化(P0.05)；與空白對照組相比較,Ap1-42作用的共培養(yǎng)組和腺病毒陰性感染組的Cytc蛋白釋放量顯著增加,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),然而后兩組相比較并無顯著性意義(P0.05)；與Aβl-42作用的共培養(yǎng)組和腺病毒陰性感染組相比較,腺病毒陽性感染組的干細(xì)胞Cytc蛋白釋放量明顯下降,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。同樣地,我們通過Western blot的檢測和q-PCR的定量分析獲得caspase-3蛋白和mRNA的表達(dá)結(jié)果均與上述Cytc釋放的結(jié)果一致。這提示我們：Hsp75蛋白過表達(dá)減弱神經(jīng)干細(xì)胞Cytc釋放,從而降低caspase-3酶的活化,阻斷了線粒體依賴的凋亡途徑。為了進一步明確Hsp75蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞釋放可溶性因子對神經(jīng)干細(xì)胞CypD表達(dá)中所起的作用,我們采用Western blot和q-PCR來檢測神經(jīng)干細(xì)胞CypD蛋白的表達(dá)和mRNA的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比較,Aβ1-42直接作用組的CypD含量顯著增加(P0.05),然而共培養(yǎng)對照組的CypD含量無明顯的變化(P0.05)；與空白對照組相比較,Aβ1-42作用的共培養(yǎng)組和腺病毒陰性感染組的CypD含量顯著增加,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),然而后兩組相比較并無顯著性意義(P0.05)；與Aβ1-42作用的共培養(yǎng)組和腺病毒陰性感染組相比較,腺病毒陽性感染組的干細(xì)胞CypD含量明顯下降,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。類似地,我們采用q-PCR方法對神經(jīng)干細(xì)胞CypD mRNA表達(dá)進行定量分析,所獲得的結(jié)果與上述CypD蛋白定量結(jié)果一致。這提示著：Hsp75蛋白的過表達(dá)降低了mPTP形成的啟動子即CypD的表達(dá)。結(jié)論1.成功克隆了人的Hsp75基因,并構(gòu)建了人Hsp75復(fù)制缺陷型腺病毒載體(Ad-Hsp75-GFP),為下一步感染神經(jīng)干細(xì)胞做了準(zhǔn)備。2.重組腺病毒成功感染C17.2神經(jīng)干細(xì)胞,感染效率高且無毒性,證實了腺病毒感染C17.2神經(jīng)干細(xì)胞是一種可行且安全的方法。3.小膠質(zhì)細(xì)胞可溶性因子誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞Hsp75表達(dá)的增多,并且隨著處理時間的延長,Hsp75蛋白增加越明顯,是神經(jīng)干細(xì)胞的一種內(nèi)源性保護反應(yīng)。4.在小膠質(zhì)細(xì)胞可溶性因子處理神經(jīng)干細(xì)胞的情況下,神經(jīng)干細(xì)胞過表達(dá)Hsp75蛋白能夠減輕可溶性因子誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性即凋亡率下降、膜電位丟失減少。5.Hsp75蛋白能夠通過減少CypD依賴型mPTP的開放,從而阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞可溶性因子誘導(dǎo)的線粒體依賴凋亡途徑的激活,起到保護神經(jīng)干細(xì)胞的作用。
【關(guān)鍵詞】：腺病毒 熱休克蛋白75 神經(jīng)干細(xì)胞 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-25
• 前言25-29
• 第一章 熱休克蛋白75重組腺病毒載體的構(gòu)建29-40
• 1. 材料與儀器29-31
• 2. 實驗方法31-37
• 3. 結(jié)果37-38
• 4. 討論38-39
• 5. 小結(jié)39-40
• 第二章 腺病毒介導(dǎo)Hsp75體外感染神經(jīng)干細(xì)胞的實驗研究40-51
• 1. 材料與儀器40-42
• 2. 實驗方法42-46
• 3. 結(jié)果46-49
• 4. 討論49-50
• 5. 小結(jié)50-51
• 第三章 神經(jīng)干細(xì)胞過表達(dá)Hsp75在小膠質(zhì)細(xì)胞可溶性因子誘導(dǎo)神經(jīng)毒性中的作用51-67
• 1. 材料與儀器52-54
• 2. 實驗方法54-59
• 3. 結(jié)果59-63
• 4. 討論63-66
• 5. 小結(jié)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-71
• 綜述71-80
• 參考文獻(xiàn)74-80
• 附錄：縮略語中英文對照表80-81
• 攻讀學(xué)位期間成果81-82
• 致謝82-83

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊樹源,安沂華;再述神經(jīng)干細(xì)胞的研究及其應(yīng)用前景[J];中華神經(jīng)外科雜志;2002年05期

2 黃鎮(zhèn),金國華,徐慧君;神經(jīng)干細(xì)胞研究進展[J];解剖科學(xué)進展;2002年01期

3 朱曉峰;神經(jīng)干細(xì)胞研究的幾個問題[J];黑龍江醫(yī)藥科學(xué);2002年05期

4 張敬軍,夏作理,劉焯霖;神經(jīng)干細(xì)胞的研究[J];泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2002年02期

5 季慶;神經(jīng)干細(xì)胞的研究近況[J];醫(yī)學(xué)綜述;2002年05期

6 田玲;;蛋白可促使神經(jīng)干細(xì)胞移動[J];國外醫(yī)學(xué)情報;2002年09期

7 張敬軍,劉焯霖;神經(jīng)干細(xì)胞的研究[J];中國病理生理雜志;2003年04期

8 張國福,林建華;神經(jīng)干細(xì)胞的研究進展[J];福建中醫(yī)藥;2003年03期

9 劉岳文,杜永紅,王可,徐正順;神經(jīng)干細(xì)胞的研究進展[J];河南科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2003年02期

10 王任直;張波;竇萬臣;鄭彤;;神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用的理論基礎(chǔ)和策略[J];醫(yī)學(xué)研究通訊;2003年09期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王華;王文輝;林蕾;;神經(jīng)干細(xì)胞的研究進展及前景展望[A];第六屆西部介入放射學(xué)術(shù)會議寧夏醫(yī)學(xué)會放射學(xué)分會第四屆年會介入放射學(xué)新技術(shù)繼續(xù)教育學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2009年

2 戴毅;韓忠朝;;神經(jīng)干細(xì)胞研究進展及臨床前景展望[A];中國解剖學(xué)會第八屆組織學(xué)與胚胎學(xué)專業(yè)青年研討會論文集[C];2004年

3 孫一睿;胡錦;王爾松;奚才華;姚海軍;;單層黏附培養(yǎng)技術(shù)在哺乳動物神經(jīng)干細(xì)胞體外穩(wěn)定增殖和多向分化中的應(yīng)用[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第四屆全國代表大會論文匯編[C];2009年

4 劉佳梅;;腦內(nèi)皮細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)促進神經(jīng)干細(xì)胞的遷移[A];中國解剖學(xué)會第十一屆全國組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2009年

5 魏勇;應(yīng)大君;張偉;董世武;;幼齡家豬腦SVZ神經(jīng)干細(xì)胞的分離與鑒定[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會2002年年會文摘匯編[C];2002年

6 司銀楚;朱培純;程龍;吳海霞;許紅;;去皮層血管對成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的影響[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會2002年年會文摘匯編[C];2002年

7 李學(xué)坤;郭安臣;左萍萍;;胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及亞克隆[A];中國藥理學(xué)會第十屆全國神經(jīng)學(xué)術(shù)會議暨浙江省藥理學(xué)會2002年年會論文摘要集[C];2002年

8 李力;萬琪;;小鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及缺血神經(jīng)元對其增殖、分化的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

9 李力;萬琪;劉永紅;張巍;;小鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及缺血神經(jīng)元對其增殖、分化的影響[A];科技、工程與經(jīng)濟社會協(xié)調(diào)發(fā)展——中國科協(xié)第五屆青年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2004年

10 徐群淵;;神經(jīng)干細(xì)胞的分離、純化和永生化[A];中國組織工程、干細(xì)胞與神經(jīng)再生學(xué)術(shù)會議論文集[C];2004年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 胡德榮;“抑制蛋白”可控制神經(jīng)干細(xì)胞提前分化[N];健康報;2007年

2 孫國根　白毅;靈長類腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)[N];中國醫(yī)藥報;2011年

3 孫國根;阻礙卒中后神經(jīng)干細(xì)胞再生的“元兇”被發(fā)現(xiàn)[N];中國醫(yī)藥報;2013年

4 ;我國科學(xué)家成功地在體外培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報;2001年

5 沈麗 付鈺;神奇的神經(jīng)干細(xì)胞[N];科技日報;2002年

6 時仲省 高思敏 劉春陽;河南醫(yī)大成功培養(yǎng)人胚神經(jīng)干細(xì)胞[N];中國醫(yī)藥報;2001年

7 梓華;神經(jīng)干細(xì)胞可治惡性腦癌[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2002年

8 許琦敏;腦損傷修復(fù)治療又有新希望[N];文匯報;2007年

9 北京市神經(jīng)外科研究所 北京天壇醫(yī)院 王忠誠邋院士;神經(jīng)修復(fù)的生力軍——神經(jīng)干細(xì)胞[N];健康報;2008年

10 孫國根;神經(jīng)干細(xì)胞并非“全能制造者”[N];中國醫(yī)藥報;2009年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張帆;Miranda磷酸化調(diào)控果蠅神經(jīng)干細(xì)胞不對稱分裂的機制[D];浙江大學(xué);2014年

2 郭立云;獼猴胚胎源性神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)、腦內(nèi)移植及其在青光眼玻璃體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸—探索性研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2013年

3 任永娟;材料調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的研究[D];清華大學(xué);2009年

4 曹翠麗;大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及向神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化[D];河北醫(yī)科大學(xué);2005年

5 周虎田;骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2005年

6 段發(fā)亮;神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)、增殖、遷移和分化的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2005年

7 許漢鵬;中樞神經(jīng)系統(tǒng)多潛能神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立及其細(xì)胞學(xué)特性的初步研究和體內(nèi)移植實驗[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2000年

8 高劍峰;海馬神經(jīng)干細(xì)胞增生分化及影響因素[D];鄭州大學(xué);2010年

9 高峰;小鼠神經(jīng)干細(xì)胞免疫原性的研究[D];浙江大學(xué);2010年

10 王霞;酒精對胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞自我更新和分化的影響研究[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李武雄;MK-801在谷氨酸-Shh信號通路中的阻斷作用[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2014年

2 馮旭;NeuroD慢病毒載體構(gòu)建及在大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的過表達(dá)[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

3 閆姍姍;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞重編程為神經(jīng)干細(xì)胞的調(diào)控機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

4 魏維;松果菊苷對神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖的影響[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2015年

5 周強意;轉(zhuǎn)TrkC神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合膠原支架對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型治療作用的實驗研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

6 孫爽;孕酮對Aβ_(25-35)損傷的神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響及機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

7 劉磊;神經(jīng)干細(xì)胞移植治療大鼠腦梗死的實驗研究[D];鄭州大學(xué);2015年

8 張濤;降鈣素基因相關(guān)肽促進體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化[D];蘇州大學(xué);2015年

9 楊明;谷氨酸/NMDA1、Shh介導(dǎo)的成體NSC增殖分化信號通路的研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

10 甘小鳳;弓形蟲抑制Wnt/β-catenin通路干擾C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的分化[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：過表達(dá)Hsp75削弱小膠質(zhì)細(xì)胞可溶性因子對神經(jīng)干細(xì)胞毒性作用與機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：436110