目的:阿爾茨海默病(AD)是以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。β淀粉樣蛋白(Aβ)清除在AD的發(fā)生發(fā)展中起到不可忽視的作用,水通道蛋白4(AQP4)的極性分布與Aβ清除密切相關,目前在AD腦中AQP4極性喪失的機制尚不明確。α-互生蛋白(SNTA1)和AQP4兩個亞型M1和M23的比例(AQP4-M1/M23)參與調節(jié)AQP4的極性分布。Sin3/組蛋白去乙酰化酶(HDAC)復合物可以調控SNTA1的表達,HDAC1和HDAC2是Sin3/HDAC復合物的核心,提示HDAC1和/或HDAC2可能參與SNTA1的調控。此外,microRNA-130a可以在轉錄水平抑制AQP4-M1的表達,從而下調AQP4-M1/M23,而microRNA-130a又可以被HDAC3抑制,提示HDAC3可能通過調節(jié)microRNA-130a的表達參與AQP4-M1/M23的調控。在AD腦中HDAC1、HDAC2和HDAC3表達均升高,組蛋白乙�；矫黠@降低。然而,SNTA1及AQP4-M1/M23在AD腦中是否發(fā)生改變尚未見報道。間歇性禁食可以使血中β-羥基丁酸(βOHB)水平升高,βOHB可以透過血腦屏障并且是一種HDACs的泛抑制劑,能夠抑制HDAC1、HDAC2和HDAC3表達,上調組蛋白乙酰化水平。因此,本研究采用APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠以及Aβ誘導的人星形膠質細胞瘤(U251)細胞系為AD模型,旨在探討AD腦中AQP4極性喪失的機制,以及間歇性禁食能否恢復AD腦中AQP4的極性分布,為AD的防治提供科學依據(jù)。研究方法:1、動物分組及處理:選取5月齡APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠及同窩出生的野生型C57/BL6小鼠,分為AD模型組和AD禁食組,野生對照組和野生禁食組。AD禁食組及野生禁食組小鼠采取攝食與禁食各24小時交替進行的干預措施,AD模型組及野生對照組小鼠實驗期間自由攝食,連續(xù)處理5個月,然后乙醚麻醉后處死。取右半腦固定于4%多聚甲醛液用于免疫熒光實驗;取左半腦,剝離皮質,用于qRT-PCR和Western Blotting實驗。2、細胞分組及處理:選用人星形膠質瘤細胞(U251),分為對照組、βOHB組、Aβ(2、10μM)組和βOHB+Aβ(2、10μM)組。βOHB組、βOHB+Aβ(2、10μM)組用1 mMβOHB預處理3小時,之后Aβ(2、10μM)組、βOHB+Aβ(2、10μM)組細胞加入終濃度為2或10μM的Aβ,繼續(xù)培養(yǎng)12小時。3、小鼠大腦皮質AQP4極性分布情況:采用免疫熒光雙標實驗檢測。4、小鼠大腦皮質及U251細胞相關mRNA表達水平分析:采用qRT-PCR方法檢測AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、SNTA1、HDAC1、HDAC2、HDAC3 mRNA及microRNA-130a相對表達水平。5、小鼠大腦皮質及U251細胞相關蛋白檢測分析:采用Western Blotting法檢測AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、SNTA1、HDAC1、HDAC2、HDAC3及乙�；慕M蛋白3第9個賴氨酸位點(Ace-H3K9)與Ace-H4K12蛋白相對表達水平。6、沉默HDAC1、HDAC2基因后U251細胞SNTA1mRNA和蛋白水平:采用siRNA干擾法沉默U251細胞的HDAC1或HDAC2基因。分別采用qRT-PCR和Western Blotting法檢測細胞中HDAC1、HDAC2、SNTA1mRNA及蛋白相對表達水平。7、microRNA-130a模擬物和抑制劑處理的U251細胞AQP4及其亞型mRNA和蛋白水平:分別采用qRT-PCR和Western Blotting法檢測。8、沉默HDAC3基因后U251細胞microRNA-130a表達及AQP4 mRNA和蛋白水平檢測:采用siRNA干擾法和HDAC3特異性抑制劑RGFP966干預沉默或抑制細胞的HDAC3基因。采用qRT-PCR法檢測microRNA-130a,分別采用qRT-PCR和Western Blotting法檢測細胞中AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、HDAC3 mRNA及蛋白相對表達水平。9、統(tǒng)計分析:采用SPSS20.0建立數(shù)據(jù)庫,進行統(tǒng)計分析。結果表示為均數(shù)±標準差。各組數(shù)值的比較均采用單因素方差分析,兩兩比較采用最小顯著差值法。P0.05時差異有統(tǒng)計學意義。結果:1、在野生對照組和野生禁食組小鼠大腦皮質中,AQP4高度定位于包繞在大腦微血管周圍星形膠質細胞的終足上,呈極性分布。在AD模型組小鼠大腦皮質中,AQP4定位發(fā)生紊亂,表現(xiàn)出定位于星形膠質細胞終足上的AQP4減少,在胞體內表達的增加。AD禁食組小鼠大腦皮質中,AQP4的極性有所恢復。2、與野生對照組小鼠比較,AD模型組小鼠大腦皮質AQP4、AQP4-M1 mRNA和蛋白表達水平升高,AQP4-M1/M23升高,SNTA1 mRNA和蛋白表達水平降低(P0.05)。與AD模型組小鼠相比,AD禁食組小鼠大腦皮質AQP4、AQP4-M1 mRNA和蛋白相對表達水平降低,AQP4-M1/M23降低,SNTA1 mRNA和蛋白表達水平升高(P0.01,P0.05)。3、與對照組相比,βOHB組細胞AQP4-M23和SNTA1 mRNA和蛋白表達水平升高,AQP4-M1/M23降低;Aβ(2μM)組細胞AQP4、AQP4-M1 mRNA和蛋白表達水平升高,AQP4-M1/M23比例升高,SNTA1 mRNA和蛋白表達水平降低;Aβ(10μM)組細胞AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、SNTA1 mRNA和蛋白表達水平降低,AQP4-M1/M23比例升高(P0.01)。與Aβ(2μM)組相比,Aβ(10μM)組細胞AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、SNTA1 mRNA和蛋白表達水平降低,βOHB+Aβ(2μM)組細胞AQP4-M1 mRNA和蛋白表達水平降低,AQP4-M23、SNTA1 mRNA和蛋白表達水平升高,AQP4-M1/M23比例降低(P0.05,P0.01)。與Aβ(10μM)組相比,βOHB+Aβ(10μM)組細胞AQP4-M23、SNTA1 mRNA和蛋白表達水平升高,AQP4-M1/M23比例降低(P0.05,P0.01)。4、與野生對照組小鼠比較,AD模型組小鼠大腦皮質Ace-H3K9和Ace-H4K12表達水平降低,HDAC1、HDAC2 mRNA和蛋白表達水平升高(P0.01)。與AD模型組小鼠相比,AD禁食組小鼠大腦皮質Ace-H3K9和Ace-H4K12表達水平升高,HDAC1、HDAC2mRNA和蛋白表達水平降低(P0.01)。5、與對照組相比,βOHB組細胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表達水平升高,HDAC1、HDAC2 mRNA和蛋白表達水平降低;Aβ(2μM)組和Aβ(10μM)組細胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表達水平降低,HDAC1、HDAC2 mRNA和蛋白表達水平升高(P0.05;P0.01)。與Aβ(2μM)組相比,Aβ(10μM)組細胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表達水平降低,HDAC1、HDAC2mRNA和蛋白表達水平升高;βOHB+Aβ(2μM)組細胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表達水平升高,HDAC1、HDAC2 m RNA和蛋白表達水平降低(P0.01)。與Aβ(10μM)組相比,βOHB+Aβ(10μM)組細胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表達水平升高,HDAC1、HDAC2 mRNA和蛋白表達水平降低(P0.01)。6、與對照組相比,沉默HDAC1后細胞SNTA1 mRNA和蛋白相對表達水平顯著性增加(P0.01)。但是,沉默HDAC2后細胞SNTA1 mRNA和蛋白相對表達水平與對照組相比未見明顯改變(P0.05)。7、與野生對照組小鼠比較,AD模型組小鼠大腦皮質miRNA-130a表達水平降低,HDAC3 mRNA和蛋白表達水平升高(P0.05,P0.01)。與AD模型組小鼠相比,AD禁食組小鼠大腦皮質miRNA-130a表達水平升高,HDAC3 mRNA和蛋白表達水平降低(P0.05,P0.01)。8、與對照組相比,βOHB組細胞miRNA-130a表達水平升高,HDAC3 mRNA和蛋白表達水平降低(P0.05);Aβ(2μM)組和Aβ(10μM)組細胞miRNA-130a表達水平降低,HDAC3mRNA和蛋白表達水平升高(P0.05,P0.01)。與Aβ(2μM)組相比,Aβ(10μM)組細胞miRNA-130a表達水平降低,HDAC3 mRNA和蛋白表達水平升高;βOHB+Aβ(2μM)組細胞mi RNA-130a表達水平升高,HDAC3 mRNA和蛋白表達水平降低(P0.05)。與Aβ(10μM)組相比,βOHB+Aβ(10μM)組細胞miRNA-130a表達水平升高,HDAC3 mRNA和蛋白表達水平降低(P0.05,P0.01)。9、與模擬物對照組細胞比較,miRNA-130a模擬物組細胞AQP4-M1 mRNA相對表達水平降低,AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23蛋白相對表達水平降低,AQP4-M1/M23比例下降(P0.05,P0.01)。與抑制劑對照組小鼠相比,miRNA-130a抑制劑組細胞AQP4-M1 mRNA相對表達水平升高,AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23蛋白相對表達水平升高,AQP4-M1/M23比例增加(P0.05,P0.01)。10、與對照組相比,采用siRNA干擾和HDAC3特異性抑制劑沉默HDAC3后細胞miRNA-130a相對表達水平顯著性增加,AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23 mRNA和蛋白表達水平升高,AQP4-M1/M23比例降低(P0.01)。結論:1、間歇性禁食可通過抑制APPswe/PS1dE9雙轉基因AD模型小鼠大腦皮質SNTA1的降低及AQP4-M1/M23的上調恢復AQP4的極性分布,βOHB可能部分介導了該作用。2、βOHB可能通過抑制HDAC1的表達介導間歇性禁食拮抗AD模型小鼠大腦皮質SNTA1表達的降低。3、βOHB對HDAC3的抑制和對miRNA-130a的上調可能是βOHB介導間歇性禁食拮抗AD模型小鼠大腦皮質AQP4-M1/M23上調的潛在機制。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

15圖 1 各組小鼠大腦皮質 AQP4 定位情況（n = 10）注：標尺為 100 μm，放大倍數(shù) 10×10。紅色、綠色熒光分別代表 CD31 及 AQP4；merge（黃色）代表定位在包繞于腦微血管周圍的星形膠質細胞的終足上的 AQP4。3.2 隔日禁食對大腦皮質 AQP4 及其各亞型 mRNA 及蛋白表達的影響如圖2所示，與野生對照組小鼠比較，AD模型組小鼠大腦皮質AQP4、AQP4-M1mRNA 相對表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與 AD 模型組小鼠相比，AD 禁食組小鼠大腦皮質 AQP4、AQP4-M1 mRNA 相對表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。各組小鼠大腦皮質 AQP4-M23 mRNA 相對表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

色）代表定位在包繞于腦微血管周圍的星形膠質細胞的終足上的 AQP4。3.2 隔日禁食對大腦皮質 AQP4 及其各亞型 mRNA 及蛋白表達的影響如圖2所示，與野生對照組小鼠比較，AD模型組小鼠大腦皮質AQP4、AQP4-M1mRNA 相對表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與 AD 模型組小鼠相比，AD 禁食組小鼠大腦皮質 AQP4、AQP4-M1 mRNA 相對表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。各組小鼠大腦皮質 AQP4-M23 mRNA 相對表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

圖 2 各組小鼠大腦皮質 AQP4 及各亞型 mRNA 相對表達水平（n =生對照組相比，*P < 0.05；與 AD 模型組相比，#P < 0.05。WT，野生對照；AD，AD 模型組；AD+ADF，AD 禁食組。 及各亞型蛋白免疫條帶和光密度分析結果見圖 3。與野生對模型組小鼠大腦皮質 AQP4、AQP4-M1 蛋白相對表達水M23 比例升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05；P < 0.01）。與AD 禁食組小鼠大腦皮質 AQP4、AQP4-M1 蛋白相對表達M23 比例降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。各組小 蛋白相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。
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本文編號：2888376