目的:阿爾茨海默病(AD)是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。β淀粉樣蛋白(Aβ)清除在AD的發(fā)生發(fā)展中起到不可忽視的作用,水通道蛋白4(AQP4)的極性分布與Aβ清除密切相關(guān),目前在AD腦中AQP4極性喪失的機(jī)制尚不明確。α-互生蛋白(SNTA1)和AQP4兩個(gè)亞型M1和M23的比例(AQP4-M1/M23)參與調(diào)節(jié)AQP4的極性分布。Sin3/組蛋白去乙�；�(HDAC)復(fù)合物可以調(diào)控SNTA1的表達(dá),HDAC1和HDAC2是Sin3/HDAC復(fù)合物的核心,提示HDAC1和/或HDAC2可能參與SNTA1的調(diào)控。此外,microRNA-130a可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制AQP4-M1的表達(dá),從而下調(diào)AQP4-M1/M23,而microRNA-130a又可以被HDAC3抑制,提示HDAC3可能通過(guò)調(diào)節(jié)microRNA-130a的表達(dá)參與AQP4-M1/M23的調(diào)控。在AD腦中HDAC1、HDAC2和HDAC3表達(dá)均升高,組蛋白乙酰化水平明顯降低。然而,SNTA1及AQP4-M1/M23在AD腦中是否發(fā)生改變尚未見報(bào)道。間歇性禁食可以使血中β-羥基丁酸(βOHB)水平升高,βOHB可以透過(guò)血腦屏障并且是一種HDACs的泛抑制劑,能夠抑制HDAC1、HDAC2和HDAC3表達(dá),上調(diào)組蛋白乙�；�。因此,本研究采用APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠以及Aβ誘導(dǎo)的人星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤(U251)細(xì)胞系為AD模型,旨在探討AD腦中AQP4極性喪失的機(jī)制,以及間歇性禁食能否恢復(fù)AD腦中AQP4的極性分布,為AD的防治提供科學(xué)依據(jù)。研究方法:1、動(dòng)物分組及處理:選取5月齡APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠及同窩出生的野生型C57/BL6小鼠,分為AD模型組和AD禁食組,野生對(duì)照組和野生禁食組。AD禁食組及野生禁食組小鼠采取攝食與禁食各24小時(shí)交替進(jìn)行的干預(yù)措施,AD模型組及野生對(duì)照組小鼠實(shí)驗(yàn)期間自由攝食,連續(xù)處理5個(gè)月,然后乙醚麻醉后處死。取右半腦固定于4%多聚甲醛液用于免疫熒光實(shí)驗(yàn);取左半腦,剝離皮質(zhì),用于qRT-PCR和Western Blotting實(shí)驗(yàn)。2、細(xì)胞分組及處理:選用人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251),分為對(duì)照組、βOHB組、Aβ(2、10μM)組和βOHB+Aβ(2、10μM)組。βOHB組、βOHB+Aβ(2、10μM)組用1 mMβOHB預(yù)處理3小時(shí),之后Aβ(2、10μM)組、βOHB+Aβ(2、10μM)組細(xì)胞加入終濃度為2或10μM的Aβ,繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。3、小鼠大腦皮質(zhì)AQP4極性分布情況:采用免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。4、小鼠大腦皮質(zhì)及U251細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)水平分析:采用qRT-PCR方法檢測(cè)AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、SNTA1、HDAC1、HDAC2、HDAC3 mRNA及microRNA-130a相對(duì)表達(dá)水平。5、小鼠大腦皮質(zhì)及U251細(xì)胞相關(guān)蛋白檢測(cè)分析:采用Western Blotting法檢測(cè)AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、SNTA1、HDAC1、HDAC2、HDAC3及乙�；慕M蛋白3第9個(gè)賴氨酸位點(diǎn)(Ace-H3K9)與Ace-H4K12蛋白相對(duì)表達(dá)水平。6、沉默HDAC1、HDAC2基因后U251細(xì)胞SNTA1mRNA和蛋白水平:采用siRNA干擾法沉默U251細(xì)胞的HDAC1或HDAC2基因。分別采用qRT-PCR和Western Blotting法檢測(cè)細(xì)胞中HDAC1、HDAC2、SNTA1mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平。7、microRNA-130a模擬物和抑制劑處理的U251細(xì)胞AQP4及其亞型mRNA和蛋白水平:分別采用qRT-PCR和Western Blotting法檢測(cè)。8、沉默HDAC3基因后U251細(xì)胞microRNA-130a表達(dá)及AQP4 mRNA和蛋白水平檢測(cè):采用siRNA干擾法和HDAC3特異性抑制劑RGFP966干預(yù)沉默或抑制細(xì)胞的HDAC3基因。采用qRT-PCR法檢測(cè)microRNA-130a,分別采用qRT-PCR和Western Blotting法檢測(cè)細(xì)胞中AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、HDAC3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平。9、統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS20.0建立數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。各組數(shù)值的比較均采用單因素方差分析,兩兩比較采用最小顯著差值法。P0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、在野生對(duì)照組和野生禁食組小鼠大腦皮質(zhì)中,AQP4高度定位于包繞在大腦微血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足上,呈極性分布。在AD模型組小鼠大腦皮質(zhì)中,AQP4定位發(fā)生紊亂,表現(xiàn)出定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞終足上的AQP4減少,在胞體內(nèi)表達(dá)的增加。AD禁食組小鼠大腦皮質(zhì)中,AQP4的極性有所恢復(fù)。2、與野生對(duì)照組小鼠比較,AD模型組小鼠大腦皮質(zhì)AQP4、AQP4-M1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高,AQP4-M1/M23升高,SNTA1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P0.05)。與AD模型組小鼠相比,AD禁食組小鼠大腦皮質(zhì)AQP4、AQP4-M1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低,AQP4-M1/M23降低,SNTA1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P0.01,P0.05)。3、與對(duì)照組相比,βOHB組細(xì)胞AQP4-M23和SNTA1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高,AQP4-M1/M23降低;Aβ(2μM)組細(xì)胞AQP4、AQP4-M1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高,AQP4-M1/M23比例升高,SNTA1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低;Aβ(10μM)組細(xì)胞AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、SNTA1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低,AQP4-M1/M23比例升高(P0.01)。與Aβ(2μM)組相比,Aβ(10μM)組細(xì)胞AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23、SNTA1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低,βOHB+Aβ(2μM)組細(xì)胞AQP4-M1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低,AQP4-M23、SNTA1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高,AQP4-M1/M23比例降低(P0.05,P0.01)。與Aβ(10μM)組相比,βOHB+Aβ(10μM)組細(xì)胞AQP4-M23、SNTA1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高,AQP4-M1/M23比例降低(P0.05,P0.01)。4、與野生對(duì)照組小鼠比較,AD模型組小鼠大腦皮質(zhì)Ace-H3K9和Ace-H4K12表達(dá)水平降低,HDAC1、HDAC2 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P0.01)。與AD模型組小鼠相比,AD禁食組小鼠大腦皮質(zhì)Ace-H3K9和Ace-H4K12表達(dá)水平升高,HDAC1、HDAC2mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P0.01)。5、與對(duì)照組相比,βOHB組細(xì)胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表達(dá)水平升高,HDAC1、HDAC2 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低;Aβ(2μM)組和Aβ(10μM)組細(xì)胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表達(dá)水平降低,HDAC1、HDAC2 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P0.05;P0.01)。與Aβ(2μM)組相比,Aβ(10μM)組細(xì)胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表達(dá)水平降低,HDAC1、HDAC2mRNA和蛋白表達(dá)水平升高;βOHB+Aβ(2μM)組細(xì)胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表達(dá)水平升高,HDAC1、HDAC2 m RNA和蛋白表達(dá)水平降低(P0.01)。與Aβ(10μM)組相比,βOHB+Aβ(10μM)組細(xì)胞Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白表達(dá)水平升高,HDAC1、HDAC2 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P0.01)。6、與對(duì)照組相比,沉默HDAC1后細(xì)胞SNTA1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著性增加(P0.01)。但是,沉默HDAC2后細(xì)胞SNTA1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平與對(duì)照組相比未見明顯改變(P0.05)。7、與野生對(duì)照組小鼠比較,AD模型組小鼠大腦皮質(zhì)miRNA-130a表達(dá)水平降低,HDAC3 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P0.05,P0.01)。與AD模型組小鼠相比,AD禁食組小鼠大腦皮質(zhì)miRNA-130a表達(dá)水平升高,HDAC3 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P0.05,P0.01)。8、與對(duì)照組相比,βOHB組細(xì)胞miRNA-130a表達(dá)水平升高,HDAC3 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P0.05);Aβ(2μM)組和Aβ(10μM)組細(xì)胞miRNA-130a表達(dá)水平降低,HDAC3mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P0.05,P0.01)。與Aβ(2μM)組相比,Aβ(10μM)組細(xì)胞miRNA-130a表達(dá)水平降低,HDAC3 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高;βOHB+Aβ(2μM)組細(xì)胞mi RNA-130a表達(dá)水平升高,HDAC3 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P0.05)。與Aβ(10μM)組相比,βOHB+Aβ(10μM)組細(xì)胞miRNA-130a表達(dá)水平升高,HDAC3 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(P0.05,P0.01)。9、與模擬物對(duì)照組細(xì)胞比較,miRNA-130a模擬物組細(xì)胞AQP4-M1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低,AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低,AQP4-M1/M23比例下降(P0.05,P0.01)。與抑制劑對(duì)照組小鼠相比,miRNA-130a抑制劑組細(xì)胞AQP4-M1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高,AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高,AQP4-M1/M23比例增加(P0.05,P0.01)。10、與對(duì)照組相比,采用siRNA干擾和HDAC3特異性抑制劑沉默HDAC3后細(xì)胞miRNA-130a相對(duì)表達(dá)水平顯著性增加,AQP4、AQP4-M1、AQP4-M23 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高,AQP4-M1/M23比例降低(P0.01)。結(jié)論:1、間歇性禁食可通過(guò)抑制APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠大腦皮質(zhì)SNTA1的降低及AQP4-M1/M23的上調(diào)恢復(fù)AQP4的極性分布,βOHB可能部分介導(dǎo)了該作用。2、βOHB可能通過(guò)抑制HDAC1的表達(dá)介導(dǎo)間歇性禁食拮抗AD模型小鼠大腦皮質(zhì)SNTA1表達(dá)的降低。3、βOHB對(duì)HDAC3的抑制和對(duì)miRNA-130a的上調(diào)可能是βOHB介導(dǎo)間歇性禁食拮抗AD模型小鼠大腦皮質(zhì)AQP4-M1/M23上調(diào)的潛在機(jī)制。
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

15圖 1 各組小鼠大腦皮質(zhì) AQP4 定位情況（n = 10）注：標(biāo)尺為 100 μm，放大倍數(shù) 10×10。紅色、綠色熒光分別代表 CD31 及 AQP4；merge（黃色）代表定位在包繞于腦微血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足上的 AQP4。3.2 隔日禁食對(duì)大腦皮質(zhì) AQP4 及其各亞型 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響如圖2所示，與野生對(duì)照組小鼠比較，AD模型組小鼠大腦皮質(zhì)AQP4、AQP4-M1mRNA 相對(duì)表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與 AD 模型組小鼠相比，AD 禁食組小鼠大腦皮質(zhì) AQP4、AQP4-M1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。各組小鼠大腦皮質(zhì) AQP4-M23 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

色）代表定位在包繞于腦微血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足上的 AQP4。3.2 隔日禁食對(duì)大腦皮質(zhì) AQP4 及其各亞型 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響如圖2所示，與野生對(duì)照組小鼠比較，AD模型組小鼠大腦皮質(zhì)AQP4、AQP4-M1mRNA 相對(duì)表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與 AD 模型組小鼠相比，AD 禁食組小鼠大腦皮質(zhì) AQP4、AQP4-M1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。各組小鼠大腦皮質(zhì) AQP4-M23 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

圖 2 各組小鼠大腦皮質(zhì) AQP4 及各亞型 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平（n =生對(duì)照組相比，*P < 0.05；與 AD 模型組相比，#P < 0.05。WT，野生對(duì)照；AD，AD 模型組；AD+ADF，AD 禁食組。 及各亞型蛋白免疫條帶和光密度分析結(jié)果見圖 3。與野生對(duì)模型組小鼠大腦皮質(zhì) AQP4、AQP4-M1 蛋白相對(duì)表達(dá)水M23 比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05；P < 0.01）。與AD 禁食組小鼠大腦皮質(zhì) AQP4、AQP4-M1 蛋白相對(duì)表達(dá)M23 比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。各組小 蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。
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本文編號(hào)：2888376