發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 06:59

　　 目的 研究Nogo-66受體(Nogo-66 receptor, NgR)能否作為藥物治療阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的潛在靶標(biāo)。此靶標(biāo)是否具備促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元突起再生和抑制β淀粉樣蛋白(amyloid P-protein, Aβ)生成的雙重作用。同時(shí)尋找具備促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元突起再生和抑制Aβ生成雙重作用的AD治療藥物。方法 (1)體外無(wú)血清培養(yǎng)新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元,采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specificenolase, NSE)和微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein2,MAP2)免疫化學(xué)染色法進(jìn)行神經(jīng)元鑒定；(2)采用不同細(xì)胞密度和不同濃度的B27培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元,觀察其對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元生長(zhǎng)的影響；(3)體外培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元,加入不同濃度的Nogo-66活性片段——Nogo-P4,用MTT法檢測(cè)不同濃度的Nogo-P4 (3.5μM、7μM、14μM)對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元的毒性作用,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,突起生長(zhǎng)狀況的定量分析,觀察Nogo-P4對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的影響,應(yīng)用ELISA (enzyme-linked immunoadsordent assay)法測(cè)定細(xì)胞分泌的Aβ42含量,觀察Nogo-P4對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元Aβ42分泌的影響；(4)體外培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元,分別加入Nogo-66受體阻斷劑NEP1-40、受體下游信號(hào)分子ROCK (rho-associated coiled coil-containing protein kinase)的抑制劑Y-27632和PKC (protein kinase C, PKC)抑制劑GO6976,采用上述指標(biāo),研究Nogo-P4影響皮質(zhì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)和Aβ42分泌的機(jī)制；(5)采用Nogo-P4制作細(xì)胞模型并進(jìn)行藥物篩選,從中藥單體中尋找有效化合物。 結(jié)果 (1)經(jīng)兩種不同的神經(jīng)元特異性標(biāo)志物(NSE和MAP-2)鑒定,確定所培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)為神經(jīng)元；(2)合適的細(xì)胞密度(1200個(gè)／mm2)和合適的B27濃度(2%B27)有利于皮質(zhì)神經(jīng)元的生長(zhǎng),神經(jīng)突起生長(zhǎng)較長(zhǎng)；(3)不同濃度的Nogo-P4對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元的存活率沒(méi)有影響,不具有細(xì)胞毒作用。不同濃度的Nogo-P4能減少有突起細(xì)胞數(shù)量,明顯降低神經(jīng)元的平均突起長(zhǎng)度,抑制皮質(zhì)神經(jīng)元突起的再生,同時(shí)還能增加培養(yǎng)基中的Aβ42含量,促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元分泌Aβ42,并具有量效關(guān)系；(4)Nogo-66受體拮抗劑NEP1-40、PKC抑制劑GO6976和ROCK抑制劑Y-27632對(duì)正常皮質(zhì)神經(jīng)元的突起生長(zhǎng)和Aβ42的分泌無(wú)影響,對(duì)Nogo-P4引起的皮質(zhì)神經(jīng)元突起再生抑制均有拮抗作用,能增加有突起細(xì)胞數(shù)量和神經(jīng)元平均突起長(zhǎng)度,對(duì)Nogo-P4引起的Aβ42生成有不同的影響。NEP1-40能促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元突起再生,但不能減少Aβ42的生成。GO6976能促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元突起再生,同時(shí)增加Aβ42的生成。Y-27632不僅能促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元突起再生,同時(shí)也能減少Aβ42的生成；(5)經(jīng)過(guò)藥物篩選,找到一個(gè)有效單體SQ,能拮抗Nogo-P4增加有突起細(xì)胞數(shù)量和神經(jīng)元平均突起長(zhǎng)度,促進(jìn)神經(jīng)元突起的再生。但SQ不能減少皮質(zhì)神經(jīng)元分泌Aβ42。結(jié)論 (1) Nogo-P4能抑制大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的突起再生,同時(shí)促進(jìn)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元分泌Aβ42; (2)Nogo-P4抑制皮質(zhì)神經(jīng)元突起再生是通過(guò)Nogo-66受體及下游信號(hào)分子ROCK和PKC的激活所引起。其促進(jìn)Aβ42的分泌與其受體下游信號(hào)分子ROCK的激活有關(guān)；(3) Nogo-66受體可以作為促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元突起再生的靶標(biāo),不能作為抑制Aβ42生成的靶標(biāo),可以作為AD治療的靶標(biāo),但不是最佳靶標(biāo)。PKC可以作為促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元突起再生的靶標(biāo),同時(shí)又是促進(jìn)Aβ42生成的靶標(biāo),綜合考慮,PKC不宜作為AD治療的靶標(biāo)。ROCK可以作為促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元突起再生和抑制Aβ42生成雙重作用的靶標(biāo),是藥物治療AD的一個(gè)理想靶標(biāo),針對(duì)此靶標(biāo)的AD治療藥物將更加有效；(4)中藥單體SQ能促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元突起再生,但不能抑制Aβ42的生成,其可能的作用靶標(biāo)是Nogo-66受體。
【學(xué)位單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)6小時(shí)細(xì)胞貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)基100林L，此時(shí)加入不同濃度的藥物，并設(shè)置溶媒對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元，藥物作用48小時(shí)后，每孔加入smgmL一，MTT15林L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后吸棄上清，加入150林L二甲基亞楓(DMSO)，在微孔板振蕩器上振蕩lomin直至晶體完全溶解。將96孔培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上，在57偽Lm波長(zhǎng)下測(cè)各孔吸光度值，定量反映細(xì)胞的存活率。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，并計(jì)算其平均值。2.5細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和定量分析24孔或96孔板培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元，細(xì)胞6小時(shí)貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)基。將不同濃度的藥物分別加入各組神經(jīng)元培養(yǎng)基中，并設(shè)置空白對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和定量分析。在倒置相差顯微鏡下(400x)觀察各組細(xì)胞的形態(tài)及突起生長(zhǎng)狀況，以胞體呈明顯暈光，長(zhǎng)出突起的皮質(zhì)神經(jīng)元為記錄對(duì)象，隨機(jī)選取32個(gè)視野進(jìn)行拍照，記錄每組神經(jīng)元的形態(tài)及突起生長(zhǎng)狀況。

多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)6小時(shí)細(xì)胞貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)基100林L，此時(shí)加入不同濃度的藥物，并設(shè)置溶媒對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元，藥物作用48小時(shí)后，每孔加入smgmL一，MTT15林L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后吸棄上清，加入150林L二甲基亞楓(DMSO)，在微孔板振蕩器上振蕩lomin直至晶體完全溶解。將96孔培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上，在57偽Lm波長(zhǎng)下測(cè)各孔吸光度值，定量反映細(xì)胞的存活率。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，并計(jì)算其平均值。2.5細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和定量分析24孔或96孔板培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元，細(xì)胞6小時(shí)貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)基。將不同濃度的藥物分別加入各組神經(jīng)元培養(yǎng)基中，并設(shè)置空白對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和定量分析。在倒置相差顯微鏡下(400x)觀察各組細(xì)胞的形態(tài)及突起生長(zhǎng)狀況，以胞體呈明顯暈光，長(zhǎng)出突起的皮質(zhì)神經(jīng)元為記錄對(duì)象，隨機(jī)選取32個(gè)視野進(jìn)行拍照，記錄每組神經(jīng)元的形態(tài)及突起生長(zhǎng)狀況。
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本文編號(hào)：2887210