第一部分基底外側(cè)杏仁核gephyrin亞硝基化修飾在大鼠焦慮樣行為中的作用目的:大量研究表明:在焦慮癥的發(fā)生發(fā)展過程中,杏仁核腦區(qū)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)及其受體介導(dǎo)的抑制性神經(jīng)突觸傳遞功能降低扮演了重要角色。橋尾蛋白(gephyrin)是調(diào)控抑制性突觸后功能的重要錨定蛋白,gephyrin通過增加GABA受體的膜穩(wěn)定性來增強抑制性突觸的抑制功能。Gephyrin的功能受到亞硝化翻譯后修飾的調(diào)控,gephyrin發(fā)生亞硝化修飾之后,其功能受到影響,對于GABA受體的膜穩(wěn)定作用發(fā)生改變,提示gephyrin的亞硝化水平的變化有可能參與誘導(dǎo)焦慮樣行為。但目前并不清楚gephyrin的亞硝化在焦慮癥等神經(jīng)精神疾病中扮演的角色及其分子機制。本研究擬采用大鼠的天然焦慮模型與慢性皮質(zhì)酮暴露誘導(dǎo)的焦慮模型,探討焦慮樣大鼠基底外側(cè)杏仁核(basolateral amygdala,BLA)腦區(qū)gephyrin亞硝化水平的變化,研究gephyrin亞硝化修飾水平在大鼠焦慮樣行為中的作用。方法:使用大鼠天然高低焦慮模型以及慢性皮質(zhì)酮暴露誘導(dǎo)的焦慮模型,通過高架十字迷宮(elevated plus maze,EPM)與曠場實驗(open field test,OFT)評價大鼠的焦慮狀態(tài)。運用western blot,�；�-生物素交換法(Acyl-biotinyl Exchange,ABE),生物素法等分子生物學(xué)方法檢測大鼠不同焦慮狀態(tài)下BLA腦區(qū)GABA_AR亞基的膜表達以及gephyrin亞硝化水平的變化。結(jié)果:通過EPM行為學(xué)將大鼠分為高焦慮鼠(high-anxiety,HA)和低焦慮鼠(low-anxiety,LA),HA鼠EPM開放臂運動運動時間(LA組:140.40±4.15 s,n=10;HA組:88.35±6.07 s,n=12,P0.0001)與運動距離(LA組:6.72±0.27 m,n=10;HA組:4.42±0.39m,n=12,P0.001)均明顯減少,HA鼠與LA鼠總運動距離無顯著性差異(LA組:12.64±0.52 m,n=10;HA組:11.98±1.08 m,n=12)。Western blotting實驗發(fā)現(xiàn)HA鼠BLA腦區(qū)GABA_ARγ2膜表達減少(LA組:1.05±0.08,HA組:0.76±0.09,n=6,P0.05),兩組大鼠GABA_ARγ2總蛋白表達無顯著性差異(LA組:1.00±0.12,HA組:1.02±0.14,n=6);同時我們檢測了GABA_ARα2,結(jié)果發(fā)現(xiàn):GABA_ARα2膜蛋白與總蛋白表達均無顯著性差異(GABA_ARα2膜蛋白:LA組:0.98±0.11,HA組:1.04±0.16,n=6;GABA_ARα2總蛋白:LA組:1.00±0.12,HA組:1.02±0.14,n=6)。HA鼠BLA腦區(qū)gephyrin亞硝化水平增加(LA組:0.74±0.08,HA組:0.98±0.04,n=6,P0.05)。為了更進一步說明gephyrin亞硝化水平與焦慮樣行為之間的關(guān)系,采用慢性皮質(zhì)酮暴露誘導(dǎo)的焦慮模型,對比溶劑組(vehicle,veh)皮質(zhì)酮暴露組(corticosterone,cort)EPM檢測中開放臂運動時間明顯減少(Veh組:121.60±6.19 s,n=6;Cort組:51.94±9.58 s,n=8,P0.001);OFT檢測中中央?yún)^(qū)的運動時間明顯減少(Veh組:134.10±21.02 s,n=6;Cort組:23.64±3.45 s,n=8,P0.0001);OFT實驗中運動總距離無顯著性差異(Veh組:13.17±2.31 m,n=6;Cort組:14.00±1.68 m,n=8)。ABE法檢測發(fā)現(xiàn)高焦慮大鼠BLA腦區(qū)gephyrin亞硝化水平增加(Veh組:0.94±0.10,n=6;Cort組:1.30±0.10,n=8,P0.05)。結(jié)論:高焦慮大鼠BLA腦區(qū)GABA_ARγ2的膜表達減少,gephyrin表達總量不變,其亞硝化水平增加。提示gephyrin的亞硝化修飾水平的變化可能參與誘導(dǎo)大鼠的焦慮樣行為。第二部分基底外側(cè)杏仁核gephyrin亞硝基化修飾誘導(dǎo)大鼠焦慮樣行為的作用機制目的:作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的酶,神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric-oxide synthase,nNOS)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)可以產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide,NO)作為信號分子調(diào)控神經(jīng)元活性,nNOS也可以通過蛋白的亞硝化修飾進而影響到下游信號。有研究表明nNOS可以調(diào)控大鼠焦慮樣行為,本文第一部分研究發(fā)現(xiàn)gephyrin亞硝化修飾在高焦慮鼠中增加,并且也有報道:gephyrin可以發(fā)生亞硝化修飾。提示nNOS有可能介導(dǎo)了gephyrin亞硝化引起焦慮樣行為的分子機制。為此,本文第二部分實驗采用藥理學(xué)和分子生物學(xué)方法調(diào)控nNOS,探討其在gephyrin亞硝化修飾在大鼠焦慮樣行為中的作用機制。方法:使用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)實驗檢測nNOS與gephyrin之間是否存在相互作用,使用ABE法檢測gephyrin的亞硝化水平,使用藥理學(xué)手段通過nNOS特異性抑制劑7-硝基吲唑(7-Nitroindazole,7-NI)與鈉離子通道特異性阻斷劑河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)抑制nNOS活性,檢測其對于gephyrin亞硝化水平的影響;分別使用慢病毒在BLA腦區(qū)過表達nNOS基因,或者系統(tǒng)給予nNOS的藥理學(xué)抑制劑7-NI,然后通過EPM和OFT行為學(xué)評價小鼠的焦慮樣行為的變化。結(jié)果:CO-IP實驗發(fā)現(xiàn)在BLA腦區(qū)nNOS和gephyrin發(fā)生相互作用,離體孵育腦片給與SNAP,發(fā)現(xiàn)SNAP(1mM)增加gephyrin的亞硝化水平(Veh組:1.01±0.12,SNAP組:2.25±0.22,n=4,P0.01),進一步通過藥理學(xué)手段使用TTX(30 uM)抑制nNOS活性,進而減少gephyrin的亞硝化水平(Veh組:1.65±0.08,TTX組:0.75±0.08,n=4,P0.001),使用甘氨酸(Glycine,Gly,200uM)通過NMDA受體激活nNOS,增加gephyrin亞硝化水平(Veh組:1.00±0.26,Gly組:1.65±0.18,n=4,P0.05);使用nNOS特異性抑制劑7-NI(100uM)取消Gly對于nNOS的激活作用,減少gephyrin的亞硝化水平(Gly組:1.65±0.19,Gly+7-NI組:1.07±0.19,n=4,P0.05);在BLA腦區(qū)特異性過表達nNOS(LV-GFP組:0.48±0.02;LV-nNOS組:0.57±0.01,n=8,P0.01)之后,EPM檢測發(fā)現(xiàn)LV-nNOS組開放臂運動時間(LV-GFP組:146.30±20.78 s,LV-nNOS組:84.48±4.68 s,n=8,P0.05)與運動距離(LV-GFP組:4.20±0.55 m,LV-nNOS組:2.56±0.23 m,n=8,P0.05)均顯著性降低;而運動總距離(LV-GFP組:7.60±0.54 m,LV-nNOS組:9.09±0.58 m,n=8)與運動平均速度(LV-GFP組:0.02±0.001m/s,LV-nNOS組:0.030±0.001 m/s,n=8)無顯著性差異;同樣,OFT的檢測結(jié)果表明:過表達nNOS明顯減少大鼠中央?yún)^(qū)的運動時間(LV-GFP組:47.21±8.34 s,LV-nNOS組:17.99±3.27 s,n=8,P0.05),OFT運動總距離無顯著性差異(LV-GFP組:14.27±0.87 m,LV-nNOS組:13.51±1.83 m,n=8),這說明過表達nNOS可以誘導(dǎo)大鼠的焦慮樣行為;使用nNOS的特異性抑制劑7-NI抑制nNOS活性之后,明顯增加開放臂進入次數(shù)(Veh組:4.88±0.63,7-NI組:7.77±0.69,n=10,P0.05)、開放臂運動運動時間(Veh組:60.56±13.05 s,7-NI組:99.37±9.69 s,n=10,P0.05)、顯著增加中央?yún)^(qū)穿梭次數(shù)(Veh組:7.66±0.97,7-NI組:12.40±1.74,n=10,P0.05)。結(jié)論:nNOS與gephyrin在BLA腦區(qū)發(fā)生相互作用,并且nNOS參與誘導(dǎo)大鼠焦慮樣行為。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R749.72
【文章目錄】：
縮略詞表（abbreviations）
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 基底外側(cè)杏仁核gephyrin亞硝基化修飾在大鼠焦慮樣行為中的作用
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
第二部分 基底外側(cè)杏仁核gephyrin亞硝基化修飾誘導(dǎo)大鼠焦慮樣行為的作用機制
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
全文總結(jié)
本文的創(chuàng)新點
展望
參考文獻
綜述:Gephyrin在中樞的功能以及其與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系
    參考文獻
攻讀碩士學(xué)位期間已發(fā)表的論文
致謝

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本文編號：2883629