背景酒精依賴者在酒精戒斷后,不僅表現(xiàn)出失眠、焦慮等癥狀,也會出現(xiàn)痛覺異常如痛覺超敏。當(dāng)酒精依賴者進(jìn)行外科手術(shù)后,常需遵醫(yī)囑戒斷酒精,然而此類病人可能出現(xiàn)與酒精戒斷相關(guān)的術(shù)后疼痛異常。酒精戒斷的動(dòng)物模型通常采用動(dòng)物被迫或自愿飲酒造成動(dòng)物酒精依賴后,再減少或停止飲酒。被迫飲酒的方法主要有灌胃、摻酒精液體食物、尾靜脈注射、酒精蒸汽和腹腔注射等;自愿飲酒指動(dòng)物自由地選擇飲用不同濃度酒精和水的混合物。術(shù)后創(chuàng)口痛動(dòng)物模型通常采用后足切口手術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生切口痛。一般情況下,術(shù)后疼痛表現(xiàn)為急性痛,源于組織損傷和相關(guān)炎性反應(yīng),僅持續(xù)一段時(shí)間。然而大約5%到75%的手術(shù)患者遭受著術(shù)后疼痛慢性化的影響。臨床患者的術(shù)后疼痛慢性化指手術(shù)后持續(xù)3個(gè)月以上的疼痛,而對于動(dòng)物模型來說,指術(shù)后持續(xù)一個(gè)月以上的疼痛。術(shù)后疼痛慢性化的過程涉及多種不同的生理機(jī)制。目前,酒精戒斷引起術(shù)后痛覺異常類型和機(jī)制均少見報(bào)道。神經(jīng)系統(tǒng)的 AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)受體改變是痛覺異常的重要機(jī)制之一。AMPA受體作為一種非選擇性陽離子通道,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性和興奮性突觸傳遞均起到重要作用。研究顯示,AMPA受體參與術(shù)后急性痛、炎性痛等過程,我們的前期研究結(jié)果顯示AMPA受體參與應(yīng)激導(dǎo)致的術(shù)后疼痛慢性化。另有研究表明,AMPA受體作為酒精的作用靶點(diǎn),調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)。因此推測AMPA受體可能參與了酒精戒斷引起的術(shù)后疼痛慢性化過程。N-cadherin和環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)是AMPA受體激活的相關(guān)蛋白。N-cadherin屬于鈣粘蛋白家族,在神經(jīng)系統(tǒng)中分布最廣,介導(dǎo)Ca2+依賴性的突觸間黏附,對AMPA受體的結(jié)構(gòu)和功能起重要作用。CREB是細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子,對中樞敏化的發(fā)生和維持至關(guān)重要。當(dāng)cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)和CaMKI和CaMKII等信號通路的激活后,引起CREB磷酸化成為pCREB(phosphorylation of CREB at Ser-133),從而參與中樞敏化發(fā)生和維持。目的觀察酒精戒斷對后足切口手術(shù)誘導(dǎo)的術(shù)后疼痛的影響,探究脊髓AMPA受體在酒精戒斷致術(shù)后疼痛慢性化中的作用。方法1、動(dòng)物分組。將8-10周齡體重20-25g的C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為對照組、手術(shù)組、酒精戒斷組和酒精戒斷+手術(shù)組。對照組不進(jìn)行任何手術(shù);手術(shù)組采用右側(cè)后足切口手術(shù);酒精戒斷組采用酒精處理但不進(jìn)行手術(shù);酒精戒斷+手術(shù)組采用酒精處理并后足切口手術(shù)。2、酒精戒斷。酒精戒斷組和酒精戒斷+手術(shù)組小鼠連續(xù)5周飲用酒精,戒斷后換成正常飲用水,戒斷次日后進(jìn)行后足切口手術(shù)。對照組和手術(shù)組始終提供正常飲用水。3、疼痛行為學(xué)測試。進(jìn)行后足切口手術(shù),采用von-Frey纖維測定后足皮膚的方法,分別在術(shù)前和術(shù)后1、3、5、7、10、20、40、60、80天測定小鼠兩側(cè)足底機(jī)械刺激撤足閾值(Paw Withdrawal Threshold,PWT)。4、酒精對體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元鈣離子內(nèi)流的影響。取胎齡14-16天的胚胎脊髓神經(jīng)元進(jìn)行原代培養(yǎng),采用25mM酒精孵育體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元,觀察其對觀察鈣離子內(nèi)流的影響。采用Fruo2AM方法,熒光顯微鏡下觀察在340nm和380nm波長下的熒光強(qiáng)度的Ratio值(F340/F380)。5、觀察酒精戒斷致術(shù)后疼痛慢性化的機(jī)制。分別在術(shù)后5、50天處死小鼠,取脊髓L4-6段組織,通過Western Blot方法檢測脊髓GluA1、GluA2、N-cadherin、CREB和pCREB(Ser133)的蛋白表達(dá)。6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,疼痛行為學(xué)采用雙因素方差分析,鈣成像采用成對t檢驗(yàn),Western Blot采用單因素方差分析,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,P0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、驗(yàn)證后足切口手術(shù)誘導(dǎo)的術(shù)后疼痛模型。機(jī)械痛行為學(xué)結(jié)果顯示,與對照組相比,手術(shù)組小鼠術(shù)后第1天到第10天手術(shù)側(cè)的PWT顯著下降(P0.05)。對側(cè)的PWT無顯著改變(P0.05)。2、酒精戒斷對疼痛行為學(xué)的影響。與對照組相比,酒精戒斷組的小鼠兩側(cè)PWT無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),并且與Baseline相比,也沒有顯著差別,提示酒精戒斷對正常小鼠疼痛閾值無顯著影響。與手術(shù)組相比,酒精戒斷+手術(shù)組小鼠在術(shù)后第10天到第60天術(shù)側(cè)PWT顯著降低(P0.05),術(shù)后第1天到第7天和術(shù)后第80天時(shí)術(shù)側(cè)PWT無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示酒精戒斷導(dǎo)致術(shù)后切口痛持續(xù)時(shí)間延長,而對正常小鼠疼痛閾值沒有影響。3、酒精孵育導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元鈣離子通透性增加,鈣內(nèi)流顯著增多(P0.05),而Ca2+通透型AMPA受體拮抗劑能夠阻斷酒精誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流(P0.05),提示Ca2+通透型AMPA受體參與酒精誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流。4、免疫印跡法檢測AMPA受體及其相關(guān)蛋白的表達(dá)。酒精戒斷組的GluA1、N-cadherin和pCREB均與對照組無明顯差異(P0.05)。術(shù)后第5天,手術(shù)組和酒精戒斷+手術(shù)組的脊髓GluA1、N-cadhernin和pCCEEB的表達(dá)均顯著增加(P0.05),提示脊髓 GluA1、N-cadheirn、pCREB 參與了術(shù)后切口痛。但術(shù)后第5天手術(shù)組和酒精戒斷+手術(shù)組之間GluA1、N-cadherin和pCREB的表達(dá)無顯著差異(P0.05)。術(shù)后第50天,手術(shù)組的GluA1、N-cadherin和pCREB的表達(dá)水平顯著下降,與對照組無顯著差異(P0.05),而酒精戒斷+手術(shù)組的GluA1、N-cadherin和pCREB的表達(dá)水平仍顯著增加(P0.05),顯著高于手術(shù)組,提示脊髓GluA1、N-cadherin、pCREB參與了酒精戒斷導(dǎo)致術(shù)后疼痛的慢性化。結(jié)論酒精戒斷可導(dǎo)致后足切口手術(shù)誘導(dǎo)的術(shù)后疼痛慢性化,脊髓AMPA受體的GluA1亞基、N-cadherin和CREB參與了該過程,而GluA2亞基不參與。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R749.62
【部分圖文】：

13圖 2.1 后足切口手術(shù)愈合過程（A）后足切口手術(shù)完成當(dāng)天；（B）術(shù)后第 1 天；（C）術(shù)后第 2 天；（D）術(shù)后第 4 天；（E）術(shù)后第 7 天；（F）術(shù)后第 9 天。分別于后足切口手術(shù)術(shù)前 1 天和術(shù)后第 1、3、5、7、10、20、40、60 和 80天各組的機(jī)械撤足閾值。通常認(rèn)為患者持續(xù) 3 個(gè)月以上的疼痛為慢性疼痛，而對于動(dòng)物模型來說，持續(xù) 1 個(gè)月以上的疼痛即被認(rèn)為是慢性疼痛。單純手術(shù)組術(shù)側(cè)的 PWT 在術(shù)后第 1 天迅速降低，術(shù)后第 3 天時(shí)降至最低點(diǎn)，之后逐漸增高，術(shù)后第 20 天時(shí)恢復(fù)至術(shù)前基礎(chǔ)值。與對照組相比，單純手術(shù)組

P <0.001；術(shù)后第 40 天，P <0.001；術(shù)后第 60 天，P <0.001，Two-way ANOVA，n=6，圖2.2A），術(shù)后第 1 天到第 7 天和術(shù)后第 80 天時(shí)無顯著差異（P >0.05，Two-wayANOVA，n=6，圖 2.2A）；對側(cè)的 PWT 在術(shù)后均無明顯變化，與手術(shù)組無顯著差異（P >0.05，Two-wayANOVA，n=6

圖 2.3 酒精孵育對脊髓神經(jīng)元鈣離子內(nèi)流的影響（A）酒精孵育對鈣離子內(nèi)流的影響（n=5）（；B）Ca2+通透型AMPA受體拮抗劑（NASPM）和酒精共同作用對鈣離子內(nèi)流的影響（n=5）；（C）25mM 酒精對鈣內(nèi)流的影響（n=5）；（D）25mM 酒精和 3mM 的 NASPM 對鈣內(nèi)流的影響（n=5），*P <0.05，paired t test, one-tailed。2.3 酒精戒斷對脊髓 AMPA 受體及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響采用 Western Blot 法檢測了各組脊髓 AMPA 受體及其相關(guān)蛋白的表達(dá)變化（圖 2.4A-E）。與對照組相比，酒精戒斷組的 GluA1、GluA2、N-cadherin、pCREB蛋白的表達(dá)均無顯著差異（P >0.05，One-wayANOVA，n=3，圖 2.4B-E），顯示酒精戒斷不會引起 AMPA 受體及其相關(guān)蛋白的表達(dá)改變。術(shù)后第 5 天檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比，手術(shù)組及酒精戒斷+手術(shù)組的 GluA1、N-cadherin、pCREB 蛋白表達(dá)均顯著增高（手術(shù)組 GluA1，P <0.01；酒精戒斷+手術(shù)組 GluA1，P <0.05。手術(shù)組 N-cadherin，P <0.001；酒精戒斷+手術(shù)組 N-cadherin，P <0.001。手術(shù)組pCREB，P <0.01；酒精戒斷+手術(shù)組 pCREB，P <0.01。One-way ANOVA，n=3，圖 2.4B、D、E），而 GluA2 表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05，One -wayANOVA，n=3，
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本文編號：2881672