目的:阿爾茨海默病(AD)是癡呆最常見的原因。神經(jīng)細胞外β淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein,Aβ1-42)異常聚集形成的老年斑是AD的病理學標志。自噬是真核細胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)。生理條件下自噬對維持細胞穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。自噬功能的異常會導致變性蛋白和損傷細胞器的積累。在發(fā)病早期的AD患者腦內(nèi),發(fā)現(xiàn)大量自噬體的存在。自噬體-溶酶體系統(tǒng)也是近年來研究Aβ沉積的新方向。自噬的調(diào)控機制非常復雜,參與到自噬中的信號通路數(shù)量繁雜,相關(guān)研究表明,微小RNA通過調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達,從而發(fā)揮對自噬進行調(diào)節(jié)作用。近年來眾多研究顯示微小RNA(MiRNAs)與AD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。其中miR-181b在正常人腦脊液及血清中十分豐富而在AD患者中顯著下降。已證實miR-181b促進神經(jīng)細胞突觸囊泡發(fā)育及促進其生長并能抑制和延緩突出囊泡的受損。這些研究表明miR-181與AD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病存在相關(guān)性,而miR-181b對AD細胞模型自噬的調(diào)節(jié)及其作用機制的信息很少。在此基礎(chǔ)上,我們構(gòu)建AD細胞模型,探討miR-181b對AD細胞自噬的影響及其作用機制,可能為AD的預防和治療提供新的靶標和方向。研究對象和方法:本研究應用PC12細胞(大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細胞)及Aβ25-35制備AD細胞模型,采用MTT法檢測PC12細胞活性,檢測加入Aβ25-35處理的細胞中透射電鏡觀察自噬體的數(shù)量、Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-II蛋白的表達水平和P70S6K,AKT及其磷酸化的蛋白在細胞中的表達變化。通過實時熒光定量PCR確定miR-181b的表達量,進一步通過轉(zhuǎn)染miR-181b mimic/inhibitor后,檢測miR-181b對Aβ25-35處理的PC12自噬的影響。結(jié)果:本實驗結(jié)果顯示在Aβ25-35處理的PC12細胞中,細胞存活率下降。同時,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達上調(diào),透射電鏡下觀察到自噬體的數(shù)目增多、miR-181b表達水平下調(diào)。轉(zhuǎn)染miR-181b mimic上調(diào)miR-181b可以保護PC12細胞免受Aβ25-35誘導的細胞毒性,提高細胞存活率,抑制Aβ25-35誘導的PC12細胞自噬。上調(diào)細胞內(nèi)miR-181b水平后,與Aβ25-35組相比,p-AKT、p-mTOR、p-P70s6k蛋白水平明顯提高,而轉(zhuǎn)染miR-181b inhibitor后結(jié)果與之相反。結(jié)論:Aβ25-35可誘導PC12細胞自噬,在AD細胞模型中miR-181b表達下調(diào)明。在Aβ25-35處理的PC12細胞中過表達miR-181b抑制細胞自噬。MiR-181b可能以mTOR依賴的方式參與了Aβ25-35誘導的自噬的調(diào)控。
【學位單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R749.16
【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
材料和方法
    1 材料試劑及主要儀器設(shè)備
        1.1 細胞來源
        1.2 試劑及耗材
        1.3 實驗儀器
        1.4 常用實驗試劑配置
        1.5 細胞培養(yǎng)方法及步驟
    2 細胞接種、轉(zhuǎn)染及分組
        2.1 實驗試劑
        2.2 實驗器材
        2.3 常用液體配置
        2.4 細胞接種、轉(zhuǎn)染miR-181b及分組
    3 透射電鏡
        3.1 實驗試劑
        3.2 操作步驟
    4 MTT法檢測細胞活力
        4.1 實驗試劑
        4.2 實驗儀器
        4.3 操作步驟
    5 實時定量PCR檢測miR-181b的水平
        5.1 實驗試劑
        5.2 實驗儀器
        5.3 PCR引物
        5.4 操作步驟
    6 Western blot法檢測AKT /p-AKT、p-P70S6K/P70S6K蛋白的水平
        6.1 實驗試劑
        6.2 實驗儀器
        6.3 抗體
        6.4 常用溶液配置
        6.5 蛋白提取和定量檢測
    7 統(tǒng)計學處理
結(jié)果
    1 Aβ25–35 處理的PC12細胞存活率下降
    2 Aβ25–35 處理的PC12細胞自噬增強
    3 Aβ25-35 處理的PC12細胞中Mi R-181b表達下調(diào)
    4 miR-181b對Aβ25-35 處理的PC12自噬的影響
    5 miR-181b可能是以m TOR依賴的方式調(diào)控Aβ25-35 誘導的自噬過程
討論
結(jié)論
參考文獻
綜述
    綜述參考文獻
攻讀學位期間的研究成果
縮略詞表
致謝

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本文編號：2881892