發(fā)布時(shí)間：2020-11-13 07:03

　　 目的:阿爾茨海默病(AD)是癡呆最常見的原因。神經(jīng)細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein,Aβ1-42)異常聚集形成的老年斑是AD的病理學(xué)標(biāo)志。自噬是真核細(xì)胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)。生理?xiàng)l件下自噬對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。自噬功能的異常會(huì)導(dǎo)致變性蛋白和損傷細(xì)胞器的積累。在發(fā)病早期的AD患者腦內(nèi),發(fā)現(xiàn)大量自噬體的存在。自噬體-溶酶體系統(tǒng)也是近年來研究Aβ沉積的新方向。自噬的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜,參與到自噬中的信號(hào)通路數(shù)量繁雜,相關(guān)研究表明,微小RNA通過調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達(dá),從而發(fā)揮對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)作用。近年來眾多研究顯示微小RNA(MiRNAs)與AD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。其中miR-181b在正常人腦脊液及血清中十分豐富而在AD患者中顯著下降。已證實(shí)miR-181b促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞突觸囊泡發(fā)育及促進(jìn)其生長(zhǎng)并能抑制和延緩?fù)怀瞿遗莸氖軗p。這些研究表明miR-181與AD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病存在相關(guān)性,而miR-181b對(duì)AD細(xì)胞模型自噬的調(diào)節(jié)及其作用機(jī)制的信息很少。在此基礎(chǔ)上,我們構(gòu)建AD細(xì)胞模型,探討miR-181b對(duì)AD細(xì)胞自噬的影響及其作用機(jī)制,可能為AD的預(yù)防和治療提供新的靶標(biāo)和方向。研究對(duì)象和方法:本研究應(yīng)用PC12細(xì)胞(大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細(xì)胞)及Aβ25-35制備AD細(xì)胞模型,采用MTT法檢測(cè)PC12細(xì)胞活性,檢測(cè)加入Aβ25-35處理的細(xì)胞中透射電鏡觀察自噬體的數(shù)量、Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-II蛋白的表達(dá)水平和P70S6K,AKT及其磷酸化的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)變化。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR確定miR-181b的表達(dá)量,進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染miR-181b mimic/inhibitor后,檢測(cè)miR-181b對(duì)Aβ25-35處理的PC12自噬的影響。結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在Aβ25-35處理的PC12細(xì)胞中,細(xì)胞存活率下降。同時(shí),自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào),透射電鏡下觀察到自噬體的數(shù)目增多、miR-181b表達(dá)水平下調(diào)。轉(zhuǎn)染miR-181b mimic上調(diào)miR-181b可以保護(hù)PC12細(xì)胞免受Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性,提高細(xì)胞存活率,抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬。上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-181b水平后,與Aβ25-35組相比,p-AKT、p-mTOR、p-P70s6k蛋白水平明顯提高,而轉(zhuǎn)染miR-181b inhibitor后結(jié)果與之相反。結(jié)論:Aβ25-35可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞自噬,在AD細(xì)胞模型中miR-181b表達(dá)下調(diào)明。在Aβ25-35處理的PC12細(xì)胞中過表達(dá)miR-181b抑制細(xì)胞自噬。MiR-181b可能以mTOR依賴的方式參與了Aβ25-35誘導(dǎo)的自噬的調(diào)控。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R749.16
【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
材料和方法
    1 材料試劑及主要儀器設(shè)備
        1.1 細(xì)胞來源
        1.2 試劑及耗材
        1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.4 常用實(shí)驗(yàn)試劑配置
        1.5 細(xì)胞培養(yǎng)方法及步驟
    2 細(xì)胞接種、轉(zhuǎn)染及分組
        2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2 實(shí)驗(yàn)器材
        2.3 常用液體配置
        2.4 細(xì)胞接種、轉(zhuǎn)染miR-181b及分組
    3 透射電鏡
        3.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.2 操作步驟
    4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力
        4.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.3 操作步驟
    5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-181b的水平
        5.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        5.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.3 PCR引物
        5.4 操作步驟
    6 Western blot法檢測(cè)AKT /p-AKT、p-P70S6K/P70S6K蛋白的水平
        6.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        6.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        6.3 抗體
        6.4 常用溶液配置
        6.5 蛋白提取和定量檢測(cè)
    7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
結(jié)果
    1 Aβ25–35 處理的PC12細(xì)胞存活率下降
    2 Aβ25–35 處理的PC12細(xì)胞自噬增強(qiáng)
    3 Aβ25-35 處理的PC12細(xì)胞中Mi R-181b表達(dá)下調(diào)
    4 miR-181b對(duì)Aβ25-35 處理的PC12自噬的影響
    5 miR-181b可能是以m TOR依賴的方式調(diào)控Aβ25-35 誘導(dǎo)的自噬過程
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    綜述參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間的研究成果
縮略詞表
致謝

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