發(fā)布時間：2020-11-03 13:38

　　 目的: 構(gòu)建過表達(dá)GSK3β慢病毒載體顆粒,觀察小鼠海馬齒狀回區(qū)注射慢病毒后GSK-3β表達(dá)的改變,研究慢病毒介導(dǎo)的海馬GSK3β過表達(dá)對小鼠糖水實驗、懸尾實驗、強迫游泳等行為的影響,通過慢性應(yīng)激造模小鼠,初步探討GSK3β與抑郁障礙的關(guān)系。 方法: 1、構(gòu)建GSK3β基因過表達(dá)的含綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的慢病毒載體。2、將實驗動物分為3組:正常組、空載體組和GSK3β過表達(dá)組,分別將1ul空載體和含GSK3β基因的慢病毒載體定位注射空載體組和GSK3β過表達(dá)組小鼠海馬齒狀回區(qū),7天后灌注取腦組織做冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察GFP與GSK3β表達(dá)情況,以及取新鮮組織提取總蛋白及總RNA,通過western blot和RT-PCR的方法檢測GSK3β的表達(dá)情況;3、48只C57BL/6J小鼠隨機分為6組,每組8只,分別為①Lvx-GSK3β+CMS組②Lvx-GSK3β組③Lvx-GFP+CMS組④Lvx-GFP組⑤正常對照+CMS⑥正常對照組。①-④組手術(shù)后7天,進(jìn)行21天的CMS,并觀察各組小鼠糖水實驗、懸尾實驗、強迫游泳實驗的變化。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建出GSK3β的T克隆載體;2.成功構(gòu)建過表達(dá)GSK3β的慢病毒;3.慢病毒定位注射后7天,GSK3β過表達(dá)組小鼠海馬組織內(nèi)GSK3βmRNA水平和蛋白水平明顯高于空白組與空載體組(P=0.001),而空白組與空載體組GSK3βmRNA和蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P0.05);定位注射后7天,GSK3β過表達(dá)組小鼠海馬齒狀回區(qū)GSK3β陽性細(xì)胞數(shù)量多,染色深;空白組與空載體組GSK3β陽性細(xì)胞較少,染色淺;4.糖水實驗結(jié)果單因素方差分析顯示組間存在明顯差異(F=11.5)。LVX-GSK3β組和LVX-GFP組T檢驗,顯示LVX-GSK3β組糖水偏愛明顯低于LVX-GFP組(P=0.001), LVX-GSK3β組和正常對照組T檢驗,顯示LVX-GSK3β組糖水偏愛明顯低于正常對照組(P=0.001),而LVX-GFP組和正常對照組間則未發(fā)現(xiàn)差異。LVX-GSK3β+CMS組和LVX-GFP+CMS組T檢驗,顯示LVX-GSK3β+CMS組糖水偏愛明顯低于LVX-GFP+CMS組(P=0.023), LVX-GSK3β+CMS組和正常對照+CMS組T檢驗,顯示LVX-GSK3β+CMS組糖水偏愛明顯低于正常對照+CMS組(P=0.025)。但LVX-GFP+CMS組和正常對照+CMS組間則未發(fā)現(xiàn)差異;LVX-GSK3β+CMS組與LVX-GSK3β組間沒有發(fā)現(xiàn)差異,但有一偏低的趨勢(P=0.088);5.強迫游泳實驗結(jié)果單因素方差分析顯示組間存在明顯差異(F=35.35)。LVX-GSK3β組和LVX-GFP組T檢驗,顯示LVX-GSK3β組不動時間明顯高于LVX-GFP組(P=0.001), LVX-GSK3β組和正常對照組T檢驗,顯示LVX-GSK3β組不動時間明顯高于正常對照組(P=0.001),而LVX-GFP組和正常對照組間則未發(fā)現(xiàn)差異。LVX-GSK3β+CMS組和LVX-GFP+CMS組T檢驗,顯示LVX-GSK3β+CMS組不動時間明顯高于LVX-GFP+CMS組(P=0.003), LVX-GSK3β+CMS組和正常對照+CMS組T檢驗,顯示LVX-GSK3β+CMS組不動時間明顯高于正常對照+CMS組(P=0.035),但LVX-GFP+CMS組和正常對照+CMS組間則未發(fā)現(xiàn)差異。LVX-GSK3β+CMS組與LVX-GSK3β組T檢驗,結(jié)果顯示LVX-GSK3β+CMS組不動時間明顯高于LVX-GSK3β組(P=0.001)。6.懸尾實驗結(jié)果單因素方差分析顯示組間存在明顯差異(F=8.17)。LVX-GSK3β組和LVX-GFP組T檢驗,顯示LVX-GSK3β組不動時間明顯高于LVX-GFP組(P=0.036), LVX-GSK3β組和正常對照組T檢驗,顯示LVX-GSK3β組不動時間明顯高于正常對照組(P=0.026),而LVX-GFP組和正常對照組間則未發(fā)現(xiàn)差異。LVX-GSK3β+CMS組和LVX-GFP+CMS組T檢驗,顯示LVX-GSK3β+CMS組不動時間明顯高于LVX-GFP+CMS組(P=0.03), LVX-GSK3β+CMS組和正常對照+CMS組T檢驗,顯示LVX-GSK3β+CMS組不動時間明顯高于正常對照+CMS組(P=0.046),但LVX-GFP+CMS組和正常對照+CMS組間則未發(fā)現(xiàn)差異。LVX-GSK3β+CMS組與LVX-GSK3β組T檢驗,結(jié)果顯示LVX-GSK3β+CMS組不動時間明顯高于LVX-GSK3β組(P=0.005)。 結(jié)論: 1、成功構(gòu)建過表達(dá)GSK3β慢病毒。2、成功建立過表達(dá)GSK3β的動物模型。3、過表達(dá)GSK3β的小鼠,在沒有應(yīng)激時,其糖水實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗均與正常組有明顯的差異。提示小鼠海馬GSK3β的增多會產(chǎn)生抑郁樣行為。4、LVX-GSK3β的小鼠,在應(yīng)激后,其糖水實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗的結(jié)果均與LVX-GFP+CMS組和正常對照+CMS組有明顯差異,并且在強迫游泳實驗和懸尾實驗中發(fā)現(xiàn)LVX-GSK3β+CMS組不動時間明顯高于LVX-GSK3β組,提示過表達(dá)GSK3β小鼠可能對應(yīng)激更加敏感。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R749.4
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)結(jié)果、慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果1.1 T 克隆載體的雙酶切鑒定結(jié)果構(gòu)建的 T 克隆載體選擇 6個克隆子進(jìn)行雙酶切鑒定，由圖 1.可知 1/6號酶切鑒定結(jié)果顯示出了正確的大小為 1263 bp 酶切條帶，所以編號為 1 和 6為正確的 T 克隆載體。1 2 3 4 5 6

圖 1.T 克隆載體的雙酶切鑒定結(jié)果1.2 轉(zhuǎn)化后的 GSK3β-T 酶切鑒定進(jìn)行轉(zhuǎn)化后的 GSK3β-T 酶切鑒定，從我們可以發(fā)現(xiàn) 1-4 個正確的轉(zhuǎn)化子（圖 2），其中 1、2、4 的結(jié)果較好，從 3 個中任續(xù)的實驗。

對照病毒 Lvx-zsgreen Lvx-GSK3β-zsgreen圖 3. 293T 細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果（20×）1.4 在體實驗的 RT-PCR 和 Western Blot 檢測小鼠海馬 GSK3β 的表達(dá)水平1、 慢病毒定位注射后 7 天，取小鼠海馬組織，利用 RT-PCR 檢測海馬內(nèi) GSKmRNA 水平，發(fā)現(xiàn) GSK3β 過表達(dá)組 GSK3β mRNA 水平明顯高于空白組與空載體（P=0.001）；而空白組與空載體組 GSK3β mRNA 表達(dá)水平無明顯差異（P0.05）。圖 4. 慢病毒注射后 7 天各組小鼠海馬 GSK3β mRNA水平空白組 空載體組 GSK3β 過表達(dá)組GSK3ββ - actin
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號：2868648