研究背景： 阿爾茨海默病(AD)是一種原因不明,以進行性認知功能障礙、行為和人格障礙等為主要臨床特征的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病。Aβ是構成神經炎性斑的核心和血管沉積物的主要成分,被認為是AD最重要的致病物質之一。AD的病因和發(fā)病機制至今尚不清楚,越來越多的證據(jù)提示炎癥反應在AD的病因和病理過程中具有重要作用,同時也是AD動物模型致病的一個主要原因。胰高血糖素樣肽1(GLP-1)是由腸道內分泌L細胞分泌的腸促胰島素,具有親神經性,對神經元軸突的生長,神經元的營養(yǎng)有一定的調節(jié)作用,能防護谷氨酸誘導的凋亡和氧化應激損傷,可能成為具有潛在價值的治療AD的新方法。量子點(QDs)是一種新型的熒光分子探針,具有熒光強度高、激發(fā)光譜連續(xù)而寬、光學穩(wěn)定性好等優(yōu)勢。應用量子點探針活體成像觀察Aβ的動態(tài)變化及藥物對AD的療效,對阿爾茨海默病的早期診斷與早期治療具有十分重要的意義。 研究目的： 本研究通過水迷宮和分子生物學方法探討GLP-1及衍生物對AD可能保護作用及機制,利用量子點-抗體探針活體追蹤GLP-1干預前后AD轉基因模型Aβ的變化,探討GLP-1治療AD的療效及其神經保護作用機制。研究方法：1.將正常C57BL小鼠隨機分3組：QDs組、QDs-Ap-Ab組、對照組,各組小鼠分別行量子點、量子點-Ap-Ab探針、PBS側腦室注射后,采用組織形態(tài)學和動物行為學觀察,應用石墨爐原子吸收光譜法檢測血、尿中鎘含量,全自動生化檢測儀測定肝腎功能,系統(tǒng)考察量子點和制備的探針的生物毒性作用。 2.將飼養(yǎng)10月和16月的APP轉基因鼠、正常C57BL小鼠隨機分為：T10組、GLP-1A組、GLP-1±ExA組、正常組和T16組、GLP-1B組、GLP-1+ExB組、正常組,側腦室連續(xù)注藥后行水迷宮實驗,并取材進行形態(tài)學觀察,利用ELISA方法檢測TNF-α和IL-1p蛋白含量,采用免疫組織化學和量子點熒光組織化學方法檢測GFAP、Aβ、GLP-1R蛋白的表達,Real-time PCR檢測GLP-1R mRNA基因的表達,Western blot檢測p-p38MAPK蛋白含量的變化。 3.利用動物活體整體熒光成像系統(tǒng)和體視顯微鏡監(jiān)測T10組、T16組、GLP-1A組和正常組量子點探針標記Aβ的變化,檢測3天后斷頭取腦組織冰凍切片,熒光顯微鏡觀察,驗證Aβ的變化。 研究結果： 1、瓊脂糖凝膠電泳檢測到目的條帶,證明量子點-Ap-Ab探針制備成功。毒性檢測HE染色示QDs-Ap-Ab組海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)、結構與對照組相似；尼氏染色示探針組海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)正常,尼氏體清晰可見,與對照組無差異；石墨爐原子吸收光譜法檢測示側腦室QDs與QDs-Ap-Ab探針注射后12h,尿鎘含量較對照組明顯增加,1-7dQDs組、探針組的尿鎘含量與對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義；行為學觀察7d,三組小鼠進食進水正常,二便正常,無舉尾、皮膚毛發(fā)顏色改變,無步態(tài)異常、興奮抑制反應,均無死亡；QDs組和QDs-Ap-Ab組血清ALT、AST、BUN和CRE水平與對照組無明顯差異(P0.05)。 2、T10組、T16組空間學習記憶能力、思考應變能力明顯下降；海馬神經元受損明顯,線粒體結構不清；IL-1p、TNFα含量明顯增多,GFAP、Aβ、GLP-1R蛋白表達明顯增高,Aβ、GLP-1R蛋白表達區(qū)域部分重疊；GLP-1RmRNA水平增高明顯；p-p38蛋白含量增多。側腦室連續(xù)5d注射GLP-1后,GLPA組小鼠空間學習記憶能力、思考應變能力明顯改善,GLPB組小鼠空間學習記憶能力、思考應變能力改善不明顯；GLPA組L-1p、TNFα含量較T10組明顯下降,GFAP、Aβ、GLP-1R蛋白表達明顯減少,GLP-1RmRNA水平明顯降低；p-p38蛋白含量減低。用GLP-1和Exendin Fragment9-39同時干預T10組,其空間學習記憶能力、IL-1p、TNFα含量、GFAP、Aβ、GLP-1R蛋白表達量、GLP-1RmRNA水平、p-p38蛋白含量與T10組無明顯差異。 3、NH2-QDs-605腦內非特異性積聚較QDs-605明顯NH2-QDs-605在腦脊液中光學特性穩(wěn)定,生物相容性好。量子點-Ap-Ab探針標記16月和10月轉基因鼠Ap,發(fā)現(xiàn)前者熒光范圍較后者擴大,連續(xù)觀測3天,量子點熒光強度沒有衰減；GLP-1干預10月APP轉基因鼠5天后,其熒光范圍減小,熒光亮度降低；腦組織冰凍切片觀測驗證了上述結果。 研究結論： 1.成功構建了量子點-Ap-Ab探針,在一定的條件下,量子點及量子點-Ap-Ab探針對小鼠整體毒性作用小,生物相容性好。 2.GLP-1R在APP轉基因模型海馬組織、大腦皮層中表達增高,證實GLP-1可能通過與GLP-1R結合,參與減緩炎癥反應、改善APP轉基因鼠的學習和記憶能力。 3.GLP-1抑制腦組織中p38MAPK活化是減輕APP轉基因鼠腦內的炎癥反應的可能機制之一。 4.量子點-Ap-Ab探針可應用于活體動物腦內研究,并能有效識別APP轉基因鼠腦內的Ap沉積。 5.量子點-Ap-Ab探針熒光成像可以應用于AD轉基因模型抗p淀粉樣蛋白斑塊干預的療效檢測。
【學位單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

博十學位論文第一章1.3方法1.3.1制備量子點一Ap一Ab探針，見圖1一1，)Ad沁日t.NHZ·QDs腳油Su柏，3MCC，--O咯夕、稼又l34入忿O，碩重皿黔N“·浦‘‘百‘‘.‘赴‘’產只‘麗了弓一健里里里鄉(xiāng)一‘N一心二。_，遙置刁龔罷井為_《里皿卜“一“。·、丸_圖1一1量子點一Ap一Ab探針的制備(l)取高質量水溶性Cdse億ns核一殼型氨基官能團量子點(NHZ一QDs);(2)sulfo一SMCC(Sulfosueeinimidyl4一困一maleimidomehyl』eyelohexane小earboxylate)活化;(3)脫鹽柱純化，得到活化的氨基官能團量子點 (ActivatedNHZ一QDS，Ac一QDS);(4)Beta一淀粉樣膚抗體在DTT(l

1.4.2量子點一Ap一Ab探針對活體動物組織形態(tài)的影響 1.4.2.1HE染色三組小鼠腦組織海馬CAI區(qū)HE染色，見圖1一ZA、圖1一ZB、圖1一ZC:QDs組和QDs一Ap一Ab組海馬CAI區(qū)細胞排列整齊、均勻，細胞結構完整，與對照組相似。圖l一4各組海馬CAI區(qū)HE染色x40oA圖:對照組B圖:QDs組C圖:QDs一Ap一Ab組1.4.2.2尼氏染色在光鏡下，QDs組和QDs一Ap一Ab組小鼠海馬CAI區(qū)示錐體細胞層神經元排列整齊且緊密，形態(tài)正常，胞漿中尼氏體清晰可見，與對照組無差異。見圖1一3A，圖l一3B，圖l一3C。

CZ圖:QDs一p.Ab組x4001.4.3小鼠尿及血中福含量 (l)QDs組、QDs一p一Ab組和對照組尿福含量如圖1一6所示，側腦室QDs與QDs一Ap一Ab復合物探針注射后12h，尿福含量較對照組明顯增加伊獄。.01)，之后的1一7dQDs組、QDs一Ap一Ab組的尿福含量與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 (2)QDs組、QDs一Ap一Ab組和對照組血福含量如圖1一6所示，三組血福含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。己J﹁nn乙O乙錫尿QdsQDs一Ap一Abeontrol︸︸︸、、、勺一n..玉‘1. m9z| 0.sdld 3dsd觀測時間(d)圖1石各組尿偏含童的變化注:與對照組比較， *P<0.01
【參考文獻】

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1 賈建平,賈健民,周衛(wèi)東,徐敏,楚長彪,閆欣,孫永馨;Differential acetylcholine and choline concentrations in the cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer’s disease and vascular dementia[J];Chinese Medical Journal;2004年08期

本文編號：2864622