前言阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一種慢性進行性神經(jīng)退行性腦病,其典型的臨床病理學改變?yōu)锳β(β-amyloid Protein)沉積形成的老年斑,細胞內(nèi)的神經(jīng)元纖維纏結,海馬錐體細胞顆�？张葑冃院图性谄雍秃ｑR的神經(jīng)元缺失。Aβ的神經(jīng)毒性尤其是Aβ1-42致神經(jīng)元凋亡機制的研究一直是AD發(fā)病機制的研究熱點。目前認為Aβ引起氧化應激損傷對于AD的發(fā)生發(fā)展意義重大,研究證實Aβ可能通過激活NMDA受體而促進氧自由基的生成引起神經(jīng)元損傷。線粒體對氧化應激損傷極其敏感,持續(xù)氧化損傷將迅速破壞線粒體結構和功能,可以引起更為嚴重的能量供應障礙,而且線粒體內(nèi)膜損傷將直接導致線粒體膜電位的降低和線粒體膜通透性孔道(membrane permeability transitionpore, MPTP)的過度開放,導致細胞色素C以及其他凋亡誘導因子大量釋放入胞漿,成為啟動細胞凋亡的關鍵因素。由于線粒體在Aβ神經(jīng)毒性作用機制,細胞氧化應激損傷和神經(jīng)元凋亡中的重要地位,近年來它被認為是AD等神經(jīng)退行性疾病治療藥物的有效作用靶點。丁基苯酞(L-3-n-butyphthalide, NBP)是從芹菜籽中提取,是我國心腦血管領域第一個擁有自主知識產(chǎn)權的新藥,作為抗腦缺血藥物,對其作用機制的研究已經(jīng)比較深入,研究表明,丁基苯酞能夠有效提高線粒體膜流動性,增加神經(jīng)細胞線粒體ATP酶活性,穩(wěn)定線粒體膜并且增加線粒體ComplexⅣ的活性。由此推測,該藥對治療以線粒體損害為關鍵環(huán)節(jié)或伴隨有線粒體功能障礙的神經(jīng)系統(tǒng)變性病會有所幫助。臨床已有實驗性的使用丁基苯酞來治療如阿爾茨海默病,帕金森病,肌萎縮側索硬化等一系列神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,然而丁基苯酞拮抗Aβ1-42致神經(jīng)元凋亡的線粒體保護作用機制尚未得到系統(tǒng)闡述。 目的研究β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide, Aβ1-42)致原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元凋亡作用機制同時使用丁基苯酞進行干預,并且進一步探討丁基苯酞對Aβ1-42致神經(jīng)元凋亡線粒體保護作用及作用機制。 方法運用細胞原代培養(yǎng)的方法培養(yǎng)皮層神經(jīng)元,采用微管相關蛋白-2(MAP-2)免疫熒光化學染色進行鑒定。利用10μmol/L(終濃度)的Aβ1-42對原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元進行干預建立AD細胞凋亡模型。分別采用不同濃度的NBP (0.1μmol/L, 1μmol/L,10μmol/L)預處理原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元4h,繼續(xù)使用10μmol/L的Aβ1-42作用24h。從而將實驗細胞隨機分為5個組：A組：空白對照組；B組：Aβ1-42 (10μmol/L)干預組；C組：Aβ1-42+0.1μmol/L NBP預處理干預組；D組：Aβ1-42+1μmol/L NBP干預組;E組：Aβ1-42+10μmol/L NBP干預組。Aβ1-42作用24h后采用四唑鹽(MTT)比色法檢測細胞存活率,分光光度法檢測各個處理組培養(yǎng)基中LDH、MDA、SOD水平,MAP-2和DAPI雙染免疫熒光法染色觀察細胞形態(tài)、計算凋亡細胞比率,Western Blot定量檢測法檢測總P38 MAPK,磷酸化p38 MAPK, Bcl-2, Bax,線粒體和胞漿中Cytc, Caspase-3, Cleaved caspase-3等線粒體凋亡途徑相關蛋白的表達水平變化。 結果1.Aβ1-42作用于原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元24h后細胞存活率顯著下降(p0.05),神經(jīng)元凋亡率顯著增加(p0.05), MDA含量和LDH活性明顯增高,SOD活性明顯下降(p0.05), Bax, Capsase-3, Cleaved caspase-3,胞漿中Cytc表達增加,Bc1-2和線粒體內(nèi)Cytc表達下降(p0.05),磷酸化p38 MAPK的表達明顯增加(p0.05),總P38 MAPK的表達未見明顯變化(p0.05)。 2.10μmol/L NBP預處理可以使細胞存活率明顯升高(p0.05),細胞凋亡率明顯降低(p0.05), MDA含量和LDH活性下降、SOD活性增高(p0.05)。 3.10μmol/L NBP預處理可以拮抗Aβ1-42引起的Bax, Capsase-3, Cleaved caspase-3,胞漿中Cytc表達增加,Bc1-2和線粒體內(nèi)Cytc表達下降(p0.05),同時減少磷酸化p38 MAPK的表達(p0.05),總p38 MAPK未見明顯變化。 結論NBP可以抑制Aβ1-42導致的AD神經(jīng)元凋亡,拮抗Aβ1-42引起引起氧化應激,通過減少氧化應激的水平和p38 MAPK的磷酸化,調節(jié)線粒體凋亡途徑相關蛋白的表達發(fā)揮保護作用抑制AD神經(jīng)元凋亡。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

NBP預處理對A日1一42處理的神經(jīng)元細胞存活率的影啊

圖2.NBP預處理對Apl一42處理的神經(jīng)元LD}1、MDA、SOD的影響。*p<O，05VSA組.#p<0.05vsB組.x士5.n=5.F19.2飛’heeffeetsofNBPpretreatfnentsontheaetivitiesofLDH、MDA、SODofneuronsinjuredbyA日1一42.*P<0.05vsAgrouP.#P<0.05vsBgroup.Mean士SD.n二5.24

山勻、人學碩十學位論文PretreatmentgrouP.MagnifieationXZOO.圖3一2.Effect()f’\Bl〕()nA日l一吸2indueedapoptosisineortiealneur()ns.*p<().05vsAgroup.共P<().05vsBgroup.Mean士SD.n=5.
【參考文獻】

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本文編號：2854330