阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的神經(jīng)退行性疾病,其典型的病理學(xué)特征包括：淀粉樣斑塊(即老年斑Senior Plaque, SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFT)和神經(jīng)突觸減少或神經(jīng)元丟失。β—淀粉樣多肽(β-amyloid peptide, A β)被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及認(rèn)知功能衰退的主要致病物質(zhì)。大量動物試驗(yàn)研究表明,針對Aβ的免疫療法可以有效減少APP轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)聚集的Aβ纖維,而且能夠明顯改善AD模型鼠的認(rèn)知狀況�？笰β抗體研究為AD治療提供了新思路,可能成為AD治療的新途徑。但是抗Aβ單克隆抗體要發(fā)揮作用需要進(jìn)入AD病變部位以清除Aβ斑塊。但是血腦屏障的存在阻止了其從血液循環(huán)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì),使其應(yīng)用潛力受到限制。探索研究大分子蛋白藥物如何穿過或繞過血腦屏障到大腦中樞系統(tǒng)發(fā)揮更有效作用是當(dāng)前面臨的一個很大挑戰(zhàn)和迫切需要解決的難題。 目前臨床上治療中樞疾病的大分子藥多采用靜脈、腹腔方式給藥,但是進(jìn)入大腦實(shí)質(zhì)真正發(fā)揮藥效的藥物的極少。雖然腦室或腦實(shí)質(zhì)內(nèi)注射可使藥物有效作用于大腦病變部位,但其具有創(chuàng)傷性且可能造成感染、出血等并發(fā)癥,因此難以在臨床工作中廣泛展開。 近年來鼻腔給藥引起了臨床研究者越來越多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)鼻腔給藥可以避開血腦屏障經(jīng)嗅覺通路進(jìn)入腦內(nèi),避免腹腔或靜脈注射途徑中經(jīng)血液循環(huán)入腦而引起的全身副作用,且所需藥物劑量低、吸收迅速無首過效應(yīng)、給藥方便等。但是鼻腔給藥也有缺點(diǎn),就是主要靠被動滲透作用進(jìn)入腦內(nèi),因此效率仍比較低,而且對分子量較小的物質(zhì)效果更好,而對于分子量較大的抗Aβ單克隆抗體效率較差。 近年來研究發(fā)現(xiàn)霍亂毒素B亞單位(Cholera Toxin B subunit, CB)能與神經(jīng)細(xì)胞膜表面的神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)配體特異結(jié)合,經(jīng)嗅神經(jīng)細(xì)胞軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)至大腦內(nèi)。其受體配體結(jié)合主動轉(zhuǎn)運(yùn)的特性使得鼻腔給藥后轉(zhuǎn)運(yùn)的效率大大提高。 因此,本課題采用將抗Aβ單克隆抗體與CB偶聯(lián),之后將偶聯(lián)物采用鼻腔給藥方式。研究抗Aβ單抗繞過血腦屏障進(jìn)入大腦海馬部位的效率及改善情況,為老年性癡呆(AD)的免疫治療探索更有效途徑。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括：一、抗Aβ1-42單克隆抗體制備及鑒定；二、抗Aβ單克隆抗體與CB偶聯(lián)方法及效率研究；三、偶聯(lián)物(CB-IgG)經(jīng)鼻給藥進(jìn)入大腦的效率研究;四、抗體經(jīng)鼻給藥進(jìn)入APP模型鼠腦內(nèi)后與Aβ斑塊結(jié)合的研究。 一.抗Aβ142單克隆抗體制備及其性質(zhì)鑒定 抗A β單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)增殖、接種小鼠腹腔,腹水用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Elisa)檢測抗Aβ單克隆抗體的效價。用ProteinA親和層析法分離純化抗Aβ單克隆抗體。SDS-PAGE電泳、Western Blot分析鑒定單抗的純度及亞型。最終得到了IgG型抗Aβ1-42的單抗,其腹水效價達(dá)1：1×106,經(jīng)Protein A親和層析柱純化抗體,純度可達(dá)90%以上。經(jīng)與病變腦組織切片免疫組化染色證實(shí),該抗體具體很好的生物學(xué)活性,可以用于后續(xù)動物實(shí)驗(yàn)。 二.抗A β1-42單克隆抗體與CB偶聯(lián)方法及標(biāo)記效率研究 運(yùn)用CB能與神經(jīng)細(xì)胞膜表面的神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)配體特異結(jié)合,經(jīng)嗅神經(jīng)細(xì)胞軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)至大腦內(nèi)的載體特性,分別采用戊二醛法及改良的過碘酸鈉法,將CB與抗Aβ單抗偶聯(lián)和效率比較。結(jié)果顯示戊二醛法偶聯(lián)后在160KD及180KD出現(xiàn)新的蛋白條帶,可能為戊二醛形成的多聚體,其偶聯(lián)率約為10%。而過碘酸鈉法偶聯(lián)后在75KD出現(xiàn)新的蛋白條帶,該條帶為抗Aβ單抗輕鏈與CB結(jié)合,其偶聯(lián)率約為總IgG量的20%。因此我們最后采用改良的過碘酸鈉法。其標(biāo)記率較高,偶聯(lián)物各成分活性保持的較好。 三.CB-IgG繞過血腦屏障進(jìn)入小鼠大腦的效率研究 CB-IgG組及各對照組分別經(jīng)小鼠鼻腔給藥,用Western半定量分析、免疫組化及MRI方法檢測單抗進(jìn)入小鼠大腦部位的量及效率比較。 檢測結(jié)果為：CB-IgG組有60%的IgG進(jìn)入大腦中,IgG組有12%進(jìn)入大腦,CB-IgG組較IgG組效率高5倍。免疫組織化學(xué)檢測顯示IgG主要進(jìn)入齒狀回的顆粒細(xì)胞和CA1區(qū)的椎體細(xì)胞,在齒狀回CB-IgG組陽性細(xì)胞為IgG組的5倍(P0.01),在CA1區(qū)CB-IgG組陽性細(xì)胞較少,CB-IgG組陽性細(xì)胞為IgG組的3倍。磁共振彌散張量成像分析顯示,CB-IgG組較IgG組對大腦區(qū)產(chǎn)生的影響更明顯(P0.01)。 CB-IgG偶聯(lián)物鼻腔給藥可以繞過血腦屏障將更多抗Aβ單抗進(jìn)入腦內(nèi)海馬部位,其效率比單用IgG提高了5倍,為研究老年性癡呆免疫治療的更有效途徑提供了新的思路。 四、抗體鼻腔進(jìn)入APP模型鼠腦內(nèi)后與斑塊結(jié)合的研究 用核磁共振成像技術(shù)檢測模型鼠與正常鼠腦DTI參數(shù)相比,FA值增大,且兩者之間有顯著差異(P0.05)。間接說明APP鼠大腦內(nèi)斑塊沉積、神經(jīng)元變性壞死等一系列變化。 免疫組化方法檢測顯示：APP模型鼠淀粉樣沉積主要集中在大腦內(nèi)海馬區(qū)齒狀回及齒狀回鄰近的大腦皮層(嗅球-海馬區(qū))。而鼻腔注射抗體一周后,免疫組化染色可見到抗體進(jìn)入腦內(nèi)在海馬區(qū)及鄰近的大腦皮層(嗅球-海馬區(qū))陽性染色。而對照組免疫組化未見陽性染色。說明抗體鼻腔進(jìn)入APP模型鼠大腦后可以與腦內(nèi)的Aβ淀粉樣斑塊結(jié)合。 結(jié)論：將CB用改良的過碘酸鈉法與單抗偶聯(lián),偶聯(lián)效率為20%；鼻腔給藥后CB-IgG偶聯(lián)物可以繞過血腦屏障將更多抗Ap單抗帶入腦內(nèi)海馬部位,其效率比單用IgG提高了約5倍；給APP模型鼠鼻腔注射抗體一周后,可見到抗體進(jìn)入腦內(nèi)在海馬區(qū)及鄰近的大腦皮層(嗅球-海馬區(qū))與淀粉樣斑塊結(jié)合。為研究AD免疫治療的更有效途徑提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R749.16
【文章目錄】：
目錄
摘要
Abstract
縮略詞表
前言
實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)方案
    一、抗Aβ1-42單克隆抗體制備及鑒定
    二、抗Aβ單克隆抗體與CB偶聯(lián)方法及效率比較
    三、偶聯(lián)物（CB-IgG）經(jīng)鼻給藥進(jìn)入大腦的效率比較
    四、抗體經(jīng)鼻給藥進(jìn)入APP模型鼠腦內(nèi)后與Aβ斑塊結(jié)合
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    一、抗Aβ1-42單克隆抗體制備及鑒定結(jié)果
    二、抗Aβ單克隆抗體與CB偶聯(lián)方法及效率結(jié)果
    三、偶聯(lián)物（CB-IgG）經(jīng)鼻給藥進(jìn)入大腦的效率結(jié)果
    四、抗體經(jīng)鼻給藥進(jìn)入APP模型鼠腦內(nèi)后與Aβ斑塊結(jié)合結(jié)果
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1 楊志勇,汪華僑,徐杰,謝瑤,黃紹寬,袁群芳,成林平,姚志彬;阿爾茨海默病人外周血中抗淀粉樣蛋白抗體的特性[J];解剖學(xué)研究;2005年02期

2 張卿;劉雁勇;白麗敏;石葛明;萬選才;孫紅梅;左萍萍;;霍亂毒素B亞單位-神經(jīng)生長因子耦聯(lián)制劑滴鼻對擬癡呆小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響[J];中國康復(fù)理論與實(shí)踐;2010年04期

本文編號：2854507