前言 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種發(fā)生于老年及老年前期的以進行性癡呆為主要特征的神經系統(tǒng)退行性疾病,其主要臨床特征是進行性記憶喪失、認知缺陷及嚴重的精神障礙。AD的一個主要病理學標志是腦部出現(xiàn)淀粉樣沉積,即老年斑(senil plaque,SP)。老年斑的核心成分是一種由39-43個氨基酸殘基構成的小神經肽—Aβ(β-amyloid peptide),Aβ由淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursor protein,APP)經過β-分泌酶及γ-分泌酶水解并分泌至細胞外。在正常生理狀態(tài)下,人腦內存在納摩爾級濃度的可溶性Aβ,對神經元具有神經營養(yǎng)作用。但在AD時,APP的異常剪切加工、Aβ的形成及其從可溶狀態(tài)到不溶狀態(tài)的轉變是AD發(fā)病機制中的關鍵環(huán)節(jié),近年來的研究表明鐵、銅和鋅等金屬離子與APP、β-分泌酶、γ-分泌酶和Tau蛋白的基因表達密切相關,從而參與Aβ分泌、沉積。以金屬離子及金屬離子轉運蛋白為切入點,解析AD發(fā)病機制并尋找AD治療靶點已經成為AD治療學的熱點之一。 二價金屬離子轉運體(divalent metal transporter 1,DMT1)屬于自然抵抗相關的巨噬細胞蛋白家族。DMT1蛋白有12個跨膜域,根據(jù)DMT1 mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'-untranslational region,3'-UTR)是否帶有鐵反應元件(iron-responseelement,IRE),可將DMT1分為DMT1-IRE和DMT1-nonIRE兩種異構體,二者均定位于細胞膜和胞內循環(huán)的內吞小泡膜上,參與多種二價金屬離子尤其是鐵離子的轉運,是維持細胞內二價金屬離子穩(wěn)態(tài)的重要金屬轉運蛋白之一。近年來有關DMT1與神經退行性疾病發(fā)病機理的研究引人關注,通過對帕金森病(Parkinson disease,PD)患者和PD模型鼠的研究表明,DMT1在黑質的表達顯著增強;而DMT1功能缺失鼠(mk/mk小鼠)卻能拮抗1-甲基-4-苯-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)和6-羥多巴胺誘導的PD癥狀和黑質神經元死亡。令人感興趣的是老齡大鼠腦內DMT1表達呈年齡性增高趨勢;多種炎癥因子也能使DMT1在腦內表達上調,這兩種情況均是誘發(fā)AD的重要危險因素。然而,有關DMT1與AD發(fā)病機理的研究尚未見報道。 本研究對DMT1-IRE和DMT1-nonlRE在AD病人和APP/PS1轉基因小鼠腦內的表達變化、定位分布及與Aβ的相關性進行系統(tǒng)分析,應用RNA干擾技術(RNAinterference,RNAi)探討DMT1基因沉默阻抑APP表達和Aβ分泌的效果,對深入探討腦金屬代謝紊亂與AD病理生理機制具有重要意義。 實驗方法 采用AD病人尸檢腦組織、雙轉染人APP695swe基因和人早老素(presenilin,PS-1)突變基因的AD模型小鼠(APP/PS1小鼠)及穩(wěn)定轉染APP695swe基因的SH-SY5Y細胞(APPsw細胞)為研究對象,應用免疫熒光雙標和激光共聚焦掃描顯微技術(Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)檢測DMT1在AD病人和APP/PS1小鼠腦內的定位分布及其與Aβ在老年斑內的位置關系,應用Western Blot技術檢測APP/PS1小鼠大腦皮層和海馬及APPsw細胞DMT1的表達變化,應用免疫共沉淀技術(co-immunoprecipitation,co-IP)檢測APP/PS1轉基因小鼠腦內DMT1和Aβ的蛋白相關性,應用RNAi技術阻抑DMT1基因在穩(wěn)定轉染APPsw cDNA和空質粒neo的SH-SY5Y細胞的表達,并應用Western Blot技術檢測RNAi對DMT1的基因沉默效果,應用Calcein AM熒光褪色光度法、RT-PCR技術、Western Blot技術、免疫熒光雙標技術、ELISA技術、MTT技術檢測DMT1-RNAi對細胞鐵離子轉運、APP表達、Aβ分泌和細胞生存率的影響。 實驗結果 一、DMT1異常分布和表達參與AD發(fā)生的在體研究 1、DMT1在AD病人及APP/PS1轉基因小鼠腦內的分布 免疫組織化學結果顯示,DMT1-IRE和DMT1-nonIRE免疫陽性反應產物均呈棕黃色,一在大腦皮層及海馬內均可見DMT1陽性的老年斑分布,斑塊大小不等,形狀為圓形或不規(guī)則形狀,邊界較清晰。高倍鏡下可見DMT1-IRE和DMT1-nonIRE廣泛分布到整個老年斑內。此外,DMT1-IRE還廣泛表達于淀粉樣變性的血管壁及其周圍。 免疫熒光雙標的共聚焦激光掃描結果顯示,在AD病人和APP/PS1轉基因小鼠腦內,Aβ免疫陽性的老年斑廣泛分布于大腦皮層及海馬,幾乎所有Aβ陽性的老年斑均有不同程度的DMT1表達,即DMT1和Aβ共存于老年斑內。高倍鏡觀察可見在APP/PS1轉基因小鼠腦內,Aβ主要分布于老年斑的核心,DMT1-IRE與DMT1-nonIRE在整個老年斑內均有分布,中心部位免疫陽性反應最強。而且DMT-IRE免疫熒光除了分布在老年斑中,還可見于淀粉樣變性的血管壁及其周圍。 2、DMT1在APP/PS1轉基因小鼠大腦皮層及海馬內的表達變化 Western Blot結果顯示,DMT1在APP/PS1轉基因小鼠大腦皮層和海馬內的表達均明顯高于野生型對照小鼠。其中DMT1-IRE和DMT1-nonIRE在大腦皮層的表達量分別是野生型小鼠的155.4%和158.5%;在海馬的表達量分別是野生型小鼠的256.8%和239.9%。 3、DMT1與Aβ蛋白相關性分析 Co-IP結果顯示,應用Aβ抗體對APP/PS1轉基因小鼠大腦皮層蛋白進行免疫共沉淀,經過瓊脂糖凝膠電泳,未見DMT1-IRE和DMT1-nonIRE條帶。 二、DMT1異常分布和表達參與AD發(fā)生的離體研究 1、APPSW細胞APP695表達及Aβ1-42分泌顯著增多 Western Blot檢測轉染APPsw基因的SH-SY5Y細胞APP695水平顯著高于對照組轉空質粒的neo細胞。ELISA法檢測APPsw細胞和neo細胞的條件培養(yǎng)基中Aβ1-42的水平,發(fā)現(xiàn)APPsw細胞分泌的Aβ1-42為86 pg/ml/protein,明顯高于neo細胞分泌的8 pg/ml/protein。 2、DMT1在轉染人APPsw基因的SH-SY5Y細胞中的表達變化 應用轉染人APPsw基因的SH-SY5Y細胞株作為AD細胞模型,免疫熒光雙標的共聚焦激光掃描結果顯示,APPsw細胞呈Aβ免疫陽性,而且DMT1-IRE和DMT1-nonIRE與Aβ共同表達。Western Blot結果顯示,DMT1-IRE和DMT1-nonIRE在APPsw細胞的表達均明顯高于轉染空質粒neo的對照組細胞。 3、FeSO_4對APPSW細胞和neo細胞表達DMT1的影響 Western Blot結果顯示,10和50μM的FeSO_4可使neo細胞表達DMT1-IRE顯著增高,100、200和500 gM的FeSO_4處理后DMT1-IRE的表達降低,但是APPsw細胞經不同濃度的FeSO_4處理后,DMT1-IRE表達均顯著升高,并具有隨著FeSO_4濃度升高表達增高的趨勢。不同濃度FeSO_4處理后,neo細胞和APPsw細胞表達的DMT1-nonIRE均有不同程度的增高,但與FeSO_4的濃度不具有相關性,而且APPsw細胞增高的程度更為顯著。結果提示DMT1在APPsw細胞中的表達不受鐵離子的負反饋調控,始終處于較高的水平。 三、DMT1參與APP表達和Aβ分泌的機制研究 1、RNAi對DMT1基因的沉默效果檢測 Western Blot結果顯示,RNAi可明顯抑制APPsw細胞的DMT1蛋白表達,干擾后48h為抑制效果最佳時間點,DMT1-IRE表達量為對照組的40%,DMT1-nonIRE表達量僅為對照組的20%。 Calcein AM熒光褪色光度法結果顯示,在APPsw細胞,DMT1-RNAi后48h,APPsw細胞內的熒光強度明顯高于未干擾細胞,表明干擾后鐵內流減少。 2、DMT1-RNAi對APP表達和Aβ分泌的影響 RT-PCR結果顯示,RNAi可明顯抑制APP mRNA的表達,其中RNAi處理48 h后,APPsw細胞和neo細胞的APP mRNA水平分別降低了36.4%和29.2%析因分析顯示DMT1-RNAi對APPsw細胞的APP mRNA表達的影響更為顯著。 Western Blot結果顯示,RNAi可明顯抑制APPsw細胞的APP695蛋白表達,并且抑制程度與干擾效率呈時間依賴性。neo細胞的APP695表達也有一定程度的降低。析因設計方差分析結果顯示,DMT1-RNAi后,ApPsw細胞的APP695蛋白表達量降低的更為顯著。 ELISA結果顯示,干擾48 h后,APPsw分泌的Aβ1-42由干擾前的86pg/ml/protein下降為62 pg/ml/protein。neo細胞分泌的Aβ1-42也有一定程度的降低,但并無統(tǒng)計學意義。 3、DMT1-RNAi可拮抗金屬離子對細胞生存率的影響 MTT結果顯示,APPsw細胞生存率隨培養(yǎng)液中FeSO_4、FeCl_3、CuSO_4和ZnSO_4濃度的升高而降低,選擇可使APPsw細胞的生存率降低20%左右的100μM FeSO_4、100μM FeCl_3、50μM CuSO_4和50μM ZnSO_4作為處理因素。正常培養(yǎng)條件下,DMT1-RNAi對細胞生存率幾乎沒有影響,但是RNAi可以逆轉100μM FeSO_4、100μM FeCl_3和50μM CuSO_4引起的APPsw細胞生存率降低。但對50μM ZnSO_4處理的APPsw細胞生存率沒有影響。 4、DMT1-RNAi可拮抗金屬離子誘導的APP蛋白表達上調Aβ分泌 Western Blot結果顯示,100μM FeSO_4、100μM FeCl_3和50μM CuSO_4處理可分別使APPsw細胞APP695蛋白表達升高,而DMT1-RNAi可拮抗金屬離子誘導的APP蛋白表達上調。但DMT1-RNAi對50μM ZnSO_4處理的APPsw細胞表達的APP695水平沒有影響。 ELISA結果顯示,100μM FeSO_4可使APPsw分泌的Aβ1-42從86 pg/ml/protein升高至98 pg/ml/protein,而DMT1-RNAi后APPsw細胞分泌Aβ1-42的水平降低至90pg/ml/protein。 結論 1、DMT1-IRE和DMT1-nonIRE與Aβ共表達于AD患者和APP/PS1轉基因小鼠腦內老年斑和淀粉樣變性的血管壁及其周圍腦組織。DMT1-IRE和DMT1-nonIRE在APP/PS1轉基因小鼠大腦皮層和海馬的表達均高于野生型小鼠。 2、DMT1-IRE和DMT1-nonlRE在穩(wěn)定轉染APPsw基因的SH-SY5Y細胞表達均高于轉染空質粒的SH-SY5Y細胞,并且不受Fe~(2+)的反饋調控。。 3、DMT1-RNAi可明顯降低穩(wěn)定轉染APPsw基因的SH-SY5Y細胞的APP表達和Aβ分泌,而且APP的表達抑制程度與DMT1-RNAi效率一致。 4、金屬離子鐵、銅和鋅能降低APPsw細胞的生存率,而DMT1-RNAi可拮抗金屬離子的作用,提高細胞生存率;同時鐵、銅和鋅能上調APPsw細胞內APP蛋白表達水平,使分泌性Aβ產生增多,DMT1-RNAi可顯著降低金屬離子誘導的APP蛋白表達水平和Aβ1-42分泌水平。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

即OM‘I’l不 !JAp共存J幾APP/PSI轉荃因小鼠大腦皮層老年斑內(圖2)。高倍鏡卜顯示斑塊結構i青晰，斑塊，掃央部位的Ap陽性反應較強刀}二向斑塊周圍呈放射性分布(圖ZF，L)。DMTI免疫陽性反應，卉二物彌散分布于整個斑塊，以中央部位最強，周邊較弱(圖2(子，M)，與A日陽瞇分布基本一致(圖211，N)。DMTI在APP護sl小鼠海馬老年斑內的分布與皮層相似。一IRE一nonIRE圖2

轉染APPSw的SI不SYSY細胞中DMTI一IRE和DM丁1一nonIRE的表達也明顯高于轉空質粒的對照組細胞，這與在體研究結果相一致，其中DMTI一IRE和DMTI一nonlRE表達分別丁卜啟J了58.4%和36.1%(圖7)。隨后我們對這兩種細胞進行了三重免疫熒光標記，共聚焦激光掃描顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)DM1’l一IRE和DMTI一nonIRE主要分布于細胞質中，而且在APllsw細胞中二者與Ap共同表達(圖8)。

圖9，F(xiàn)eSO4對APPsw細胞和neo細胞表達DMTI的影響討論銅、鐵、鋅等金屬離子是維持人體正常生理功能所必需的微量元素，在人體生理以及新陳子七謝包括神經細胞代謝過程中起到重要作用。腦內金屬離子的含必須保持在適當?shù)姆秶鷥�，如果穩(wěn)態(tài)平衡被打破就可能引發(fā)疾病。研究發(fā)現(xiàn)AD者老年斑內部以及斑塊周圍有鐵，銅和鋅富集14，7，’“一’8];Tg2576小鼠腦內老年斑
【共引文獻】

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本文編號：2847101