前言 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種發(fā)生于老年及老年前期的以進(jìn)行性癡呆為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其主要臨床特征是進(jìn)行性記憶喪失、認(rèn)知缺陷及嚴(yán)重的精神障礙。AD的一個(gè)主要病理學(xué)標(biāo)志是腦部出現(xiàn)淀粉樣沉積,即老年斑(senil plaque,SP)。老年斑的核心成分是一種由39-43個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小神經(jīng)肽—Aβ(β-amyloid peptide),Aβ由淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursor protein,APP)經(jīng)過β-分泌酶及γ-分泌酶水解并分泌至細(xì)胞外。在正常生理狀態(tài)下,人腦內(nèi)存在納摩爾級(jí)濃度的可溶性Aβ,對(duì)神經(jīng)元具有神經(jīng)營養(yǎng)作用。但在AD時(shí),APP的異常剪切加工、Aβ的形成及其從可溶狀態(tài)到不溶狀態(tài)的轉(zhuǎn)變是AD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),近年來的研究表明鐵、銅和鋅等金屬離子與APP、β-分泌酶、γ-分泌酶和Tau蛋白的基因表達(dá)密切相關(guān),從而參與Aβ分泌、沉積。以金屬離子及金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為切入點(diǎn),解析AD發(fā)病機(jī)制并尋找AD治療靶點(diǎn)已經(jīng)成為AD治療學(xué)的熱點(diǎn)之一。 二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(divalent metal transporter 1,DMT1)屬于自然抵抗相關(guān)的巨噬細(xì)胞蛋白家族。DMT1蛋白有12個(gè)跨膜域,根據(jù)DMT1 mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'-untranslational region,3'-UTR)是否帶有鐵反應(yīng)元件(iron-responseelement,IRE),可將DMT1分為DMT1-IRE和DMT1-nonIRE兩種異構(gòu)體,二者均定位于細(xì)胞膜和胞內(nèi)循環(huán)的內(nèi)吞小泡膜上,參與多種二價(jià)金屬離子尤其是鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn),是維持細(xì)胞內(nèi)二價(jià)金屬離子穩(wěn)態(tài)的重要金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一。近年來有關(guān)DMT1與神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)理的研究引人關(guān)注,通過對(duì)帕金森病(Parkinson disease,PD)患者和PD模型鼠的研究表明,DMT1在黑質(zhì)的表達(dá)顯著增強(qiáng);而DMT1功能缺失鼠(mk/mk小鼠)卻能拮抗1-甲基-4-苯-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)和6-羥多巴胺誘導(dǎo)的PD癥狀和黑質(zhì)神經(jīng)元死亡。令人感興趣的是老齡大鼠腦內(nèi)DMT1表達(dá)呈年齡性增高趨勢(shì);多種炎癥因子也能使DMT1在腦內(nèi)表達(dá)上調(diào),這兩種情況均是誘發(fā)AD的重要危險(xiǎn)因素。然而,有關(guān)DMT1與AD發(fā)病機(jī)理的研究尚未見報(bào)道。 本研究對(duì)DMT1-IRE和DMT1-nonlRE在AD病人和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的表達(dá)變化、定位分布及與Aβ的相關(guān)性進(jìn)行系統(tǒng)分析,應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(RNAinterference,RNAi)探討DMT1基因沉默阻抑APP表達(dá)和Aβ分泌的效果,對(duì)深入探討腦金屬代謝紊亂與AD病理生理機(jī)制具有重要意義。 實(shí)驗(yàn)方法 采用AD病人尸檢腦組織、雙轉(zhuǎn)染人APP695swe基因和人早老素(presenilin,PS-1)突變基因的AD模型小鼠(APP/PS1小鼠)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP695swe基因的SH-SY5Y細(xì)胞(APPsw細(xì)胞)為研究對(duì)象,應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)和激光共聚焦掃描顯微技術(shù)(Confocal Laser Scanning Microscopy,CLSM)檢測(cè)DMT1在AD病人和APP/PS1小鼠腦內(nèi)的定位分布及其與Aβ在老年斑內(nèi)的位置關(guān)系,應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)APP/PS1小鼠大腦皮層和海馬及APPsw細(xì)胞DMT1的表達(dá)變化,應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)(co-immunoprecipitation,co-IP)檢測(cè)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)DMT1和Aβ的蛋白相關(guān)性,應(yīng)用RNAi技術(shù)阻抑DMT1基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APPsw cDNA和空質(zhì)粒neo的SH-SY5Y細(xì)胞的表達(dá),并應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)RNAi對(duì)DMT1的基因沉默效果,應(yīng)用Calcein AM熒光褪色光度法、RT-PCR技術(shù)、Western Blot技術(shù)、免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)、ELISA技術(shù)、MTT技術(shù)檢測(cè)DMT1-RNAi對(duì)細(xì)胞鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)、APP表達(dá)、Aβ分泌和細(xì)胞生存率的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、DMT1異常分布和表達(dá)參與AD發(fā)生的在體研究 1、DMT1在AD病人及APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的分布 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,DMT1-IRE和DMT1-nonIRE免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物均呈棕黃色,一在大腦皮層及海馬內(nèi)均可見DMT1陽性的老年斑分布,斑塊大小不等,形狀為圓形或不規(guī)則形狀,邊界較清晰。高倍鏡下可見DMT1-IRE和DMT1-nonIRE廣泛分布到整個(gè)老年斑內(nèi)。此外,DMT1-IRE還廣泛表達(dá)于淀粉樣變性的血管壁及其周圍。 免疫熒光雙標(biāo)的共聚焦激光掃描結(jié)果顯示,在AD病人和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi),Aβ免疫陽性的老年斑廣泛分布于大腦皮層及海馬,幾乎所有Aβ陽性的老年斑均有不同程度的DMT1表達(dá),即DMT1和Aβ共存于老年斑內(nèi)。高倍鏡觀察可見在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi),Aβ主要分布于老年斑的核心,DMT1-IRE與DMT1-nonIRE在整個(gè)老年斑內(nèi)均有分布,中心部位免疫陽性反應(yīng)最強(qiáng)。而且DMT-IRE免疫熒光除了分布在老年斑中,還可見于淀粉樣變性的血管壁及其周圍。 2、DMT1在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層及海馬內(nèi)的表達(dá)變化 Western Blot結(jié)果顯示,DMT1在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層和海馬內(nèi)的表達(dá)均明顯高于野生型對(duì)照小鼠。其中DMT1-IRE和DMT1-nonIRE在大腦皮層的表達(dá)量分別是野生型小鼠的155.4%和158.5%;在海馬的表達(dá)量分別是野生型小鼠的256.8%和239.9%。 3、DMT1與Aβ蛋白相關(guān)性分析 Co-IP結(jié)果顯示,應(yīng)用Aβ抗體對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層蛋白進(jìn)行免疫共沉淀,經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳,未見DMT1-IRE和DMT1-nonIRE條帶。 二、DMT1異常分布和表達(dá)參與AD發(fā)生的離體研究 1、APPSW細(xì)胞APP695表達(dá)及Aβ1-42分泌顯著增多 Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染APPsw基因的SH-SY5Y細(xì)胞APP695水平顯著高于對(duì)照組轉(zhuǎn)空質(zhì)粒的neo細(xì)胞。ELISA法檢測(cè)APPsw細(xì)胞和neo細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中Aβ1-42的水平,發(fā)現(xiàn)APPsw細(xì)胞分泌的Aβ1-42為86 pg/ml/protein,明顯高于neo細(xì)胞分泌的8 pg/ml/protein。 2、DMT1在轉(zhuǎn)染人APPsw基因的SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)變化 應(yīng)用轉(zhuǎn)染人APPsw基因的SH-SY5Y細(xì)胞株作為AD細(xì)胞模型,免疫熒光雙標(biāo)的共聚焦激光掃描結(jié)果顯示,APPsw細(xì)胞呈Aβ免疫陽性,而且DMT1-IRE和DMT1-nonIRE與Aβ共同表達(dá)。Western Blot結(jié)果顯示,DMT1-IRE和DMT1-nonIRE在APPsw細(xì)胞的表達(dá)均明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒neo的對(duì)照組細(xì)胞。 3、FeSO_4對(duì)APPSW細(xì)胞和neo細(xì)胞表達(dá)DMT1的影響 Western Blot結(jié)果顯示,10和50μM的FeSO_4可使neo細(xì)胞表達(dá)DMT1-IRE顯著增高,100、200和500 gM的FeSO_4處理后DMT1-IRE的表達(dá)降低,但是APPsw細(xì)胞經(jīng)不同濃度的FeSO_4處理后,DMT1-IRE表達(dá)均顯著升高,并具有隨著FeSO_4濃度升高表達(dá)增高的趨勢(shì)。不同濃度FeSO_4處理后,neo細(xì)胞和APPsw細(xì)胞表達(dá)的DMT1-nonIRE均有不同程度的增高,但與FeSO_4的濃度不具有相關(guān)性,而且APPsw細(xì)胞增高的程度更為顯著。結(jié)果提示DMT1在APPsw細(xì)胞中的表達(dá)不受鐵離子的負(fù)反饋調(diào)控,始終處于較高的水平。 三、DMT1參與APP表達(dá)和Aβ分泌的機(jī)制研究 1、RNAi對(duì)DMT1基因的沉默效果檢測(cè) Western Blot結(jié)果顯示,RNAi可明顯抑制APPsw細(xì)胞的DMT1蛋白表達(dá),干擾后48h為抑制效果最佳時(shí)間點(diǎn),DMT1-IRE表達(dá)量為對(duì)照組的40%,DMT1-nonIRE表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的20%。 Calcein AM熒光褪色光度法結(jié)果顯示,在APPsw細(xì)胞,DMT1-RNAi后48h,APPsw細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯高于未干擾細(xì)胞,表明干擾后鐵內(nèi)流減少。 2、DMT1-RNAi對(duì)APP表達(dá)和Aβ分泌的影響 RT-PCR結(jié)果顯示,RNAi可明顯抑制APP mRNA的表達(dá),其中RNAi處理48 h后,APPsw細(xì)胞和neo細(xì)胞的APP mRNA水平分別降低了36.4%和29.2%析因分析顯示DMT1-RNAi對(duì)APPsw細(xì)胞的APP mRNA表達(dá)的影響更為顯著。 Western Blot結(jié)果顯示,RNAi可明顯抑制APPsw細(xì)胞的APP695蛋白表達(dá),并且抑制程度與干擾效率呈時(shí)間依賴性。neo細(xì)胞的APP695表達(dá)也有一定程度的降低。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示,DMT1-RNAi后,ApPsw細(xì)胞的APP695蛋白表達(dá)量降低的更為顯著。 ELISA結(jié)果顯示,干擾48 h后,APPsw分泌的Aβ1-42由干擾前的86pg/ml/protein下降為62 pg/ml/protein。neo細(xì)胞分泌的Aβ1-42也有一定程度的降低,但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3、DMT1-RNAi可拮抗金屬離子對(duì)細(xì)胞生存率的影響 MTT結(jié)果顯示,APPsw細(xì)胞生存率隨培養(yǎng)液中FeSO_4、FeCl_3、CuSO_4和ZnSO_4濃度的升高而降低,選擇可使APPsw細(xì)胞的生存率降低20%左右的100μM FeSO_4、100μM FeCl_3、50μM CuSO_4和50μM ZnSO_4作為處理因素。正常培養(yǎng)條件下,DMT1-RNAi對(duì)細(xì)胞生存率幾乎沒有影響,但是RNAi可以逆轉(zhuǎn)100μM FeSO_4、100μM FeCl_3和50μM CuSO_4引起的APPsw細(xì)胞生存率降低。但對(duì)50μM ZnSO_4處理的APPsw細(xì)胞生存率沒有影響。 4、DMT1-RNAi可拮抗金屬離子誘導(dǎo)的APP蛋白表達(dá)上調(diào)Aβ分泌 Western Blot結(jié)果顯示,100μM FeSO_4、100μM FeCl_3和50μM CuSO_4處理可分別使APPsw細(xì)胞APP695蛋白表達(dá)升高,而DMT1-RNAi可拮抗金屬離子誘導(dǎo)的APP蛋白表達(dá)上調(diào)。但DMT1-RNAi對(duì)50μM ZnSO_4處理的APPsw細(xì)胞表達(dá)的APP695水平?jīng)]有影響。 ELISA結(jié)果顯示,100μM FeSO_4可使APPsw分泌的Aβ1-42從86 pg/ml/protein升高至98 pg/ml/protein,而DMT1-RNAi后APPsw細(xì)胞分泌Aβ1-42的水平降低至90pg/ml/protein。 結(jié)論 1、DMT1-IRE和DMT1-nonIRE與Aβ共表達(dá)于AD患者和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑和淀粉樣變性的血管壁及其周圍腦組織。DMT1-IRE和DMT1-nonIRE在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層和海馬的表達(dá)均高于野生型小鼠。 2、DMT1-IRE和DMT1-nonlRE在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APPsw基因的SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)均高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的SH-SY5Y細(xì)胞,并且不受Fe~(2+)的反饋調(diào)控。。 3、DMT1-RNAi可明顯降低穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APPsw基因的SH-SY5Y細(xì)胞的APP表達(dá)和Aβ分泌,而且APP的表達(dá)抑制程度與DMT1-RNAi效率一致。 4、金屬離子鐵、銅和鋅能降低APPsw細(xì)胞的生存率,而DMT1-RNAi可拮抗金屬離子的作用,提高細(xì)胞生存率;同時(shí)鐵、銅和鋅能上調(diào)APPsw細(xì)胞內(nèi)APP蛋白表達(dá)水平,使分泌性Aβ產(chǎn)生增多,DMT1-RNAi可顯著降低金屬離子誘導(dǎo)的APP蛋白表達(dá)水平和Aβ1-42分泌水平。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

即OM‘I’l不 !JAp共存J幾APP/PSI轉(zhuǎn)荃因小鼠大腦皮層老年斑內(nèi)(圖2)。高倍鏡卜顯示斑塊結(jié)構(gòu)i青晰，斑塊，掃央部位的Ap陽性反應(yīng)較強(qiáng)刀}二向斑塊周圍呈放射性分布(圖ZF，L)。DMTI免疫陽性反應(yīng)，卉二物彌散分布于整個(gè)斑塊，以中央部位最強(qiáng)，周邊較弱(圖2(子，M)，與A日陽瞇分布基本一致(圖211，N)。DMTI在APP護(hù)sl小鼠海馬老年斑內(nèi)的分布與皮層相似。一IRE一nonIRE圖2

轉(zhuǎn)染APPSw的SI不SYSY細(xì)胞中DMTI一IRE和DM丁1一nonIRE的表達(dá)也明顯高于轉(zhuǎn)空質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞，這與在體研究結(jié)果相一致，其中DMTI一IRE和DMTI一nonlRE表達(dá)分別丁卜啟J了58.4%和36.1%(圖7)。隨后我們對(duì)這兩種細(xì)胞進(jìn)行了三重免疫熒光標(biāo)記，共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DM1’l一IRE和DMTI一nonIRE主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，而且在APllsw細(xì)胞中二者與Ap共同表達(dá)(圖8)。

圖9，F(xiàn)eSO4對(duì)APPsw細(xì)胞和neo細(xì)胞表達(dá)DMTI的影響討論銅、鐵、鋅等金屬離子是維持人體正常生理功能所必需的微量元素，在人體生理以及新陳子七謝包括神經(jīng)細(xì)胞代謝過程中起到重要作用。腦內(nèi)金屬離子的含必須保持在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，如果穩(wěn)態(tài)平衡被打破就可能引發(fā)疾病。研究發(fā)現(xiàn)AD者老年斑內(nèi)部以及斑塊周圍有鐵，銅和鋅富集14，7，’“一’8];Tg2576小鼠腦內(nèi)老年斑
【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2847101