CUL4B屬于Cullin家族,該家族成員參與構(gòu)成Cullin-Ring泛素連接酶(CRLs)復合物,該復合物是目前已知最大的一類泛素連接酶。CUL4B參與構(gòu)成的CRL復合物(CRL4B)可識別并特異性結(jié)合多種底物蛋白,引起底物蛋白的降解,進而調(diào)節(jié)多種生理或發(fā)育過程。本實驗室近期研究表明,CRL4B復合物可介導H2AK119單泛素化(H2AK119ub1),并通過與PRC2復合物協(xié)同作用促進H3K27三甲基化(H3K27me3),進而導致靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制。人類CUL4B基因突變可導致X連鎖精神發(fā)育遲滯綜合征(XLMR),患者還伴有身材矮小、步態(tài)異常、失語等癥狀。與人類不同,全身性敲除Cul4b基因?qū)е滦∈笈咛ブ滤馈Ｈ欢?僅敲除胚體而非胚外組織Cul4b (Cul4bSox2-Cre)的小鼠可以存活,并表現(xiàn)出空間學習障礙,與患者精神發(fā)育遲滯的表型一致。本論文主要分析了CUL4B在大腦發(fā)育過程中發(fā)揮抑制神經(jīng)前體細胞(NPCs)向GFAP陽性細胞分化的作用及其機制。首先利用體外培養(yǎng)體系,我們發(fā)現(xiàn)缺失Cul4b導致神經(jīng)前體細胞向GFAP陽性及S100β陽性星形膠質(zhì)細胞分化增多。在神經(jīng)系統(tǒng)特異性Cul4b基因敲除小鼠的大腦中也發(fā)現(xiàn)GFAP陽性細胞增多。機制分析發(fā)現(xiàn),Cul4b缺失所引起神經(jīng)前體細胞向GFAP陽性細胞分化增多是由前列腺素D2合成酶PTGDS表達上調(diào)所致。增加的GFAP陽性細胞分化可通過PTGDS抑制劑或者敲低Ptgds而得到拯救。更重要的是,加入外源性PTGDS可使野生型神經(jīng)前體細胞向GFAP陽性細胞分化增多。我們進一步發(fā)現(xiàn)Ptgds基因轉(zhuǎn)錄可被CUL4B/PRC2復合物抑制�？傊�,我們的結(jié)果證實CUL4B在神經(jīng)發(fā)育過程中對GFAP陽性細胞分化起負調(diào)控作用。本課題主要分為以下兩個部分：第一部分小鼠神經(jīng)系統(tǒng)Cul4b缺失導致GFAP陽性細胞增多為探究CUL4B是否調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細胞分化,我們將Cul4b-floxed小鼠與Nestin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配,得到神經(jīng)系統(tǒng)特異性Cul4b基因敲除小鼠(Cul4bNestin-Cre),并從胚胎發(fā)育第15.5天的Cul4bNestin-Cre胎鼠以及同窩對照胎鼠的前腦中分離神經(jīng)前體細胞進行體外培養(yǎng)。增殖及凋亡實驗顯示Cul4b缺失的神經(jīng)前體細胞與野生型并無差別,提示CUL4B不影響神經(jīng)前體細胞的增殖。隨后撤去生長因子4-8天以誘導神經(jīng)前體細胞分化。與野生型神經(jīng)前體細胞相比,Cul4b缺失的神經(jīng)前體細胞向GFAP陽性細胞分化增多。用抗S100p抗體分析也得到相同的結(jié)果。另一方面,與野生型神經(jīng)前體細胞相比,Cul4b缺失的神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元(TUJ1陽性細胞)分化減少。隨后,我們在體內(nèi)驗證了Cul4b對GFAP陽性細胞的作用。與體外實驗結(jié)果一致,GFAP陽性細胞在Cul4bNestin-Cre小鼠的多個腦區(qū)都明顯多于同窩對照小組,包括皮層、海馬、丘腦、下丘腦、紋狀體等。第二部分CUL4B調(diào)控GFAP陽性細胞分化是通過PTGDS介導的JAK-STAT通路調(diào)節(jié)GFAP基因的表達以及神經(jīng)前體細胞的神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細胞命運轉(zhuǎn)化。因此,我們研究了CUL4B在神經(jīng)前體細胞分化中的作用是否也是通過JAK-STAT通路。與野生型細胞相比,Cul4b缺失的神經(jīng)前體細胞分化過程中,磷酸化的Stat3(Y705位,Stat3的活化形式)的水平明顯升高。Cul4bNeslin-Cre小鼠的皮層和海馬區(qū)的p-STAT3水平也明顯高于同窩對照小鼠。此外,抑制p-STAT3可拯救Cul4b缺失的神經(jīng)前體細胞向星形膠質(zhì)細胞分化增多的表型。以上結(jié)果提示Cul4b缺失的神經(jīng)前體細胞向星形膠質(zhì)細胞分化增多依賴于JAK-STAT通路的激活。我們近期的研究表明,CRL4B復合物可以單泛素化H2AK119 (H2AK119ub1),并協(xié)同PRC2復合物轉(zhuǎn)錄抑制多種靶基因。與同窩對照小鼠相比,Cul4bNestin-Cre小鼠皮層中H3K27me3水平明顯降低。接下來,我們進行了芯片分析,檢測Cul4bNestin-1re小鼠大腦中哪些基因的表達發(fā)生改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ptgds在Cul4bNestin-Cre小鼠大腦中的表達明顯高于同窩對照小鼠。隨后我們用實時定量PCR.Wester1 blotting以及免疫染色等實驗證實,敲除Cul4b后PTGDS的表達明顯升高。PTGDS在Cul4b缺失的大腦及神經(jīng)前體細胞中表達升高,因此我們研究PTGDS是否介導了GFAP陽性細胞分化增多。用PTGDS的活性抑制劑AT56處理神經(jīng)前體細胞可以有效拯救GFAP陽性細胞分化增多的表型。此外,在Cul4b缺失的神經(jīng)前體細胞中通過感染含有shRNA的病毒來敲低PTGDS的表達也可拯救GFAP陽性細胞分化增多的表型。加入外源性PTGDS蛋白可顯著增加野生型神經(jīng)前體細胞向GFAP陽性細胞分化的比例�？傊�,以上結(jié)果提示CUL4B缺失導致GFAP陽性細胞分化增多是由PTGDS介導的。接下來我們通過染色質(zhì)免疫沉淀實驗檢測Ptgds基因是否可被CRL4B復合物抑制。與預期一致,ChIP實驗顯示CUL4B可直接結(jié)合至P1gds啟動子上。野生型小鼠大腦細胞中CUL4B.EZH2及H3K27me3均可在P1gds啟動子上聚集,而缺失CUL4B后EZH2不能與Ptgds啟動子結(jié)合,提示大腦中PRC2復合物結(jié)合至ptgds依賴于CRL4B復合物。ChIP結(jié)果同時證實,與對照細胞相比,Cul4b缺失的神經(jīng)前體細胞中Ptgds啟動子區(qū)域H3K27me3結(jié)合減少,H3K4me3結(jié)合增多�？傊�,以上結(jié)果證實CRL4B/PRC2復合物可通過促進H2AK119單泛素化和H3K27三甲基化來抑制Ptgds轉(zhuǎn)錄。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R749.93
【部分圖文】：

胚胎發(fā)育第１５．５天的扣餅嚴＂＇＂－ｅｖｅ胎鼠Ｗ及同窩對照胎鼠中分離神經(jīng)前體細胞進??行體外培養(yǎng)。ＣＵＬ４Ｂ免疫巧光分析顯示，ＣＵＬ４Ｂ在對照小鼠的神經(jīng)前體細胞中??高表達，而在ＣｗＷ嚴＂＂－ｎ＇ｅ小鼠的神經(jīng)前體細胞中不表達（圖１－１），說明敲除效??果良好。??Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｃｕ／４ｄ－ｎｕｌｌ??■■??圖１－１?小鼠及對照小鼠的神經(jīng)前體細胞的ＣＵＬ４Ｂ免疫焚光分析。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｏｆ?ＣＵＬ４Ｂ?ｉｎ?ＮＰＣｓ?ｏｆ?Ｃｍ／４６胞＂＂－Ｃｒｅ?ａｎｄ?ｃｏｎｔｒｏｌ??ｍｉｃｅ．??首先，我們檢測了敲除Ｃｕ／伯對神經(jīng)前體細胞的増殖和調(diào)ｔ的影響。Ｋｉ６７??免疫黃光分析結(jié)果顯示，Ｃｕ／飾敲除和對照神經(jīng)前體細胞中Ｋｉ６７陽性細胞比例??并無明顯差異（圖１－２Ａ），提示ＣＵＬ４Ｂ缺失并未影響神經(jīng)前體細胞增殖。細胞??生長曲線證實始敲除和對照神經(jīng)前體細胞的生長速度沒有明顯差異（圖??１－巧）。??２８??

體細胞均可被誘導分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。然而，ＧＦＡＰ免疫巧光實驗??分析結(jié)果顯示，與對照神經(jīng)前體細胞相比，Ｃｍ／姑敲除的神經(jīng)前體細胞向ＧＦＡＰ??陽性的星形膠質(zhì)細胞分化的比例有明顯升高（圖１－４Ａ，ｐＯ．ＯＯｌ）。Ｓｌｏｏｐ?（另一??種星形膠質(zhì)細胞的標記物）免疫焚光實驗分析結(jié)果也顯示，與對照神經(jīng)前體細胞??相比，ＣＷ如敲除的神經(jīng)前體細胞向Ｓｌｏｏｐ陽性的星形膠質(zhì)細胞分化的比例有明??顯升高（圖?１－４Ｂ，ｐＯ．Ｏｌ）。??Ａ??Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＣｕＭｂ＂曲－扣??麵？？Ｕｐ?ｉ??Ｃｏｎｔｒｏｌ??■ｍｉ?ｎ?Ｉ??０?Ｃｏｎｔｒｏｌ??圖１－４?敲除和對照神經(jīng)前體細胞向星形膠質(zhì)細胞的分化情況。??（Ａ）?ＧＦＡＰ免疫巧光實驗；（Ｂ）?Ｓｌｏｏｐ免疫巧光實驗。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４?ＣＷ如－ｎｕｌｌ?ａｎｄ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ＮＰＣｓ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔ：ｅ?ｉＭｏ?ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．??（Ａ）?Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｏｆ?ＧＦＡＰ；?（Ｂ）?１１１１１１１１１１１〇１１＂〇化８６６１１〇６?ｏｆ?Ｓｌｏｏｐ．??為檢測敲除對神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元分化的影響，我們進行了?ＴＵＪｌ??免疫巧光實驗。結(jié)果顯示，與對照神經(jīng)前體細胞相比，靴敲除的神經(jīng)前體細??胞向神經(jīng)元（ＴＵＪ１陽性細胞）分化的比例明顯降低（圖１－５

?ＣｕＭｂ，、．’ｅ如林?Ｗ??結(jié)豁嘶凍糸氣??戶令々？片、＊?Ｖ氣處奪＊；；?Ｓ??Ｖ、令＇公：巧＼、Ｖ、？媒??圖１－８?小鼠腦中的ＧＦＡＰ陽性細胞的細胞形態(tài)并無明顯改變。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－８?Ｔｈｅ?ＧＦＡＰ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ?過ｉｄ?ｎｏｔ?ｓｈｏｗ?ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ??ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ?ｃｈａｎｇｅ?ｉｎ?Ｃｗ／４々ａ化＂＂－Ｇｇ?ｍｉｃｅ．??隨后我們通過免疫姐化實驗分析了打似６Ｗａ＂＂－〇ｅ及同窩對照小鼠前腦組織中??Ｓｌｏｏｐ陽性細胞的數(shù)量。結(jié)果顯示，與野生型對照小鼠相比，仿／如Ｗｕ＂＂－ＣＶｅ小鼠??的皮層及海馬區(qū)域中Ｓｌｏｏｐ陽性細胞數(shù)量并無明顯改變（圖１－９）。??誦圓??圖＾９?Ｃ？／媒Ｗ６Ｗ＂－〇ｅ小鼠及同窩對照小鼠的前腦組織中Ｓｌｏｏｐ免疫沮織化學染色。??扔ｇｕｒｅ?１－９?Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ?ｏｆ?Ｓｌｏｏｐ?ｉｎ?化ｅ?ｆｏｒｅｂｒａｉｎｓ?ｏｆ?ａｎｄ??Ｉｈｔｅｒｍａｔｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｍｉｃｅ．??接下來我們分析了?ａ＜／飾敲除小鼠腦中神經(jīng)元的數(shù)量，對小鼠的皮層和海馬?．??３３??
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本文編號：2844452