CUL4B屬于Cullin家族,該家族成員參與構(gòu)成Cullin-Ring泛素連接酶(CRLs)復(fù)合物,該復(fù)合物是目前已知最大的一類(lèi)泛素連接酶。CUL4B參與構(gòu)成的CRL復(fù)合物(CRL4B)可識(shí)別并特異性結(jié)合多種底物蛋白,引起底物蛋白的降解,進(jìn)而調(diào)節(jié)多種生理或發(fā)育過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)室近期研究表明,CRL4B復(fù)合物可介導(dǎo)H2AK119單泛素化(H2AK119ub1),并通過(guò)與PRC2復(fù)合物協(xié)同作用促進(jìn)H3K27三甲基化(H3K27me3),進(jìn)而導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制。人類(lèi)CUL4B基因突變可導(dǎo)致X連鎖精神發(fā)育遲滯綜合征(XLMR),患者還伴有身材矮小、步態(tài)異常、失語(yǔ)等癥狀。與人類(lèi)不同,全身性敲除Cul4b基因?qū)е滦∈笈咛ブ滤馈Ｈ欢?僅敲除胚體而非胚外組織Cul4b (Cul4bSox2-Cre)的小鼠可以存活,并表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)障礙,與患者精神發(fā)育遲滯的表型一致。本論文主要分析了CUL4B在大腦發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮抑制神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCs)向GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分化的作用及其機(jī)制。首先利用體外培養(yǎng)體系,我們發(fā)現(xiàn)缺失Cul4b導(dǎo)致神經(jīng)前體細(xì)胞向GFAP陽(yáng)性及S100β陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞分化增多。在神經(jīng)系統(tǒng)特異性Cul4b基因敲除小鼠的大腦中也發(fā)現(xiàn)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增多。機(jī)制分析發(fā)現(xiàn),Cul4b缺失所引起神經(jīng)前體細(xì)胞向GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分化增多是由前列腺素D2合成酶PTGDS表達(dá)上調(diào)所致。增加的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分化可通過(guò)PTGDS抑制劑或者敲低Ptgds而得到拯救。更重要的是,加入外源性PTGDS可使野生型神經(jīng)前體細(xì)胞向GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分化增多。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Ptgds基因轉(zhuǎn)錄可被CUL4B/PRC2復(fù)合物抑制�？傊�,我們的結(jié)果證實(shí)CUL4B在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分化起負(fù)調(diào)控作用。本課題主要分為以下兩個(gè)部分：第一部分小鼠神經(jīng)系統(tǒng)Cul4b缺失導(dǎo)致GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增多為探究CUL4B是否調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞分化,我們將Cul4b-floxed小鼠與Nestin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配,得到神經(jīng)系統(tǒng)特異性Cul4b基因敲除小鼠(Cul4bNestin-Cre),并從胚胎發(fā)育第15.5天的Cul4bNestin-Cre胎鼠以及同窩對(duì)照胎鼠的前腦中分離神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。增殖及凋亡實(shí)驗(yàn)顯示Cul4b缺失的神經(jīng)前體細(xì)胞與野生型并無(wú)差別,提示CUL4B不影響神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖。隨后撤去生長(zhǎng)因子4-8天以誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞分化。與野生型神經(jīng)前體細(xì)胞相比,Cul4b缺失的神經(jīng)前體細(xì)胞向GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分化增多。用抗S100p抗體分析也得到相同的結(jié)果。另一方面,與野生型神經(jīng)前體細(xì)胞相比,Cul4b缺失的神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元(TUJ1陽(yáng)性細(xì)胞)分化減少。隨后,我們?cè)隗w內(nèi)驗(yàn)證了Cul4b對(duì)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的作用。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,GFAP陽(yáng)性細(xì)胞在Cul4bNestin-Cre小鼠的多個(gè)腦區(qū)都明顯多于同窩對(duì)照小組,包括皮層、海馬、丘腦、下丘腦、紋狀體等。第二部分CUL4B調(diào)控GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分化是通過(guò)PTGDS介導(dǎo)的JAK-STAT通路調(diào)節(jié)GFAP基因的表達(dá)以及神經(jīng)前體細(xì)胞的神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化。因此,我們研究了CUL4B在神經(jīng)前體細(xì)胞分化中的作用是否也是通過(guò)JAK-STAT通路。與野生型細(xì)胞相比,Cul4b缺失的神經(jīng)前體細(xì)胞分化過(guò)程中,磷酸化的Stat3(Y705位,Stat3的活化形式)的水平明顯升高。Cul4bNeslin-Cre小鼠的皮層和海馬區(qū)的p-STAT3水平也明顯高于同窩對(duì)照小鼠。此外,抑制p-STAT3可拯救Cul4b缺失的神經(jīng)前體細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化增多的表型。以上結(jié)果提示Cul4b缺失的神經(jīng)前體細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化增多依賴(lài)于JAK-STAT通路的激活。我們近期的研究表明,CRL4B復(fù)合物可以單泛素化H2AK119 (H2AK119ub1),并協(xié)同PRC2復(fù)合物轉(zhuǎn)錄抑制多種靶基因。與同窩對(duì)照小鼠相比,Cul4bNestin-Cre小鼠皮層中H3K27me3水平明顯降低。接下來(lái),我們進(jìn)行了芯片分析,檢測(cè)Cul4bNestin-1re小鼠大腦中哪些基因的表達(dá)發(fā)生改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ptgds在Cul4bNestin-Cre小鼠大腦中的表達(dá)明顯高于同窩對(duì)照小鼠。隨后我們用實(shí)時(shí)定量PCR.Wester1 blotting以及免疫染色等實(shí)驗(yàn)證實(shí),敲除Cul4b后PTGDS的表達(dá)明顯升高。PTGDS在Cul4b缺失的大腦及神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)升高,因此我們研究PTGDS是否介導(dǎo)了GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分化增多。用PTGDS的活性抑制劑AT56處理神經(jīng)前體細(xì)胞可以有效拯救GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分化增多的表型。此外,在Cul4b缺失的神經(jīng)前體細(xì)胞中通過(guò)感染含有shRNA的病毒來(lái)敲低PTGDS的表達(dá)也可拯救GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分化增多的表型。加入外源性PTGDS蛋白可顯著增加野生型神經(jīng)前體細(xì)胞向GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分化的比例。總之,以上結(jié)果提示CUL4B缺失導(dǎo)致GFAP陽(yáng)性細(xì)胞分化增多是由PTGDS介導(dǎo)的。接下來(lái)我們通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ptgds基因是否可被CRL4B復(fù)合物抑制。與預(yù)期一致,ChIP實(shí)驗(yàn)顯示CUL4B可直接結(jié)合至P1gds啟動(dòng)子上。野生型小鼠大腦細(xì)胞中CUL4B.EZH2及H3K27me3均可在P1gds啟動(dòng)子上聚集,而缺失CUL4B后EZH2不能與Ptgds啟動(dòng)子結(jié)合,提示大腦中PRC2復(fù)合物結(jié)合至ptgds依賴(lài)于CRL4B復(fù)合物。ChIP結(jié)果同時(shí)證實(shí),與對(duì)照細(xì)胞相比,Cul4b缺失的神經(jīng)前體細(xì)胞中Ptgds啟動(dòng)子區(qū)域H3K27me3結(jié)合減少,H3K4me3結(jié)合增多�？傊�,以上結(jié)果證實(shí)CRL4B/PRC2復(fù)合物可通過(guò)促進(jìn)H2AK119單泛素化和H3K27三甲基化來(lái)抑制Ptgds轉(zhuǎn)錄。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：R749.93
【部分圖文】：

胚胎發(fā)育第１５．５天的扣餅嚴(yán)＂＇＂－ｅｖｅ胎鼠Ｗ及同窩對(duì)照胎鼠中分離神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)??行體外培養(yǎng)。ＣＵＬ４Ｂ免疫巧光分析顯示，ＣＵＬ４Ｂ在對(duì)照小鼠的神經(jīng)前體細(xì)胞中??高表達(dá)，而在ＣｗＷ嚴(yán)＂＂－ｎ＇ｅ小鼠的神經(jīng)前體細(xì)胞中不表達(dá)（圖１－１），說(shuō)明敲除效??果良好。??Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｃｕ／４ｄ－ｎｕｌｌ??■■??圖１－１?小鼠及對(duì)照小鼠的神經(jīng)前體細(xì)胞的ＣＵＬ４Ｂ免疫焚光分析。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｏｆ?ＣＵＬ４Ｂ?ｉｎ?ＮＰＣｓ?ｏｆ?Ｃｍ／４６胞＂＂－Ｃｒｅ?ａｎｄ?ｃｏｎｔｒｏｌ??ｍｉｃｅ．??首先，我們檢測(cè)了敲除Ｃｕ／伯對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞的増殖和調(diào)ｔ的影響。Ｋｉ６７??免疫黃光分析結(jié)果顯示，Ｃｕ／飾敲除和對(duì)照神經(jīng)前體細(xì)胞中Ｋｉ６７陽(yáng)性細(xì)胞比例??并無(wú)明顯差異（圖１－２Ａ），提示ＣＵＬ４Ｂ缺失并未影響神經(jīng)前體細(xì)胞增殖。細(xì)胞??生長(zhǎng)曲線證實(shí)始敲除和對(duì)照神經(jīng)前體細(xì)胞的生長(zhǎng)速度沒(méi)有明顯差異（圖??１－巧）。??２８??

體細(xì)胞均可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。然而，ＧＦＡＰ免疫巧光實(shí)驗(yàn)??分析結(jié)果顯示，與對(duì)照神經(jīng)前體細(xì)胞相比，Ｃｍ／姑敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞向ＧＦＡＰ??陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的比例有明顯升高（圖１－４Ａ，ｐＯ．ＯＯｌ）。Ｓｌｏｏｐ?（另一??種星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物）免疫焚光實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果也顯示，與對(duì)照神經(jīng)前體細(xì)胞??相比，ＣＷ如敲除的神經(jīng)前體細(xì)胞向Ｓｌｏｏｐ陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的比例有明??顯升高（圖?１－４Ｂ，ｐＯ．Ｏｌ）。??Ａ??Ｃｏｎｔｒｏｌ?ＣｕＭｂ＂曲－扣??麵？？Ｕｐ?ｉ??Ｃｏｎｔｒｏｌ??■ｍｉ?ｎ?Ｉ??０?Ｃｏｎｔｒｏｌ??圖１－４?敲除和對(duì)照神經(jīng)前體細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化情況。??（Ａ）?ＧＦＡＰ免疫巧光實(shí)驗(yàn)；（Ｂ）?Ｓｌｏｏｐ免疫巧光實(shí)驗(yàn)。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４?ＣＷ如－ｎｕｌｌ?ａｎｄ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ＮＰＣｓ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔ：ｅ?ｉＭｏ?ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．??（Ａ）?Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｏｆ?ＧＦＡＰ；?（Ｂ）?１１１１１１１１１１１〇１１＂〇化８６６１１〇６?ｏｆ?Ｓｌｏｏｐ．??為檢測(cè)敲除對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化的影響，我們進(jìn)行了?ＴＵＪｌ??免疫巧光實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與對(duì)照神經(jīng)前體細(xì)胞相比，靴敲除的神經(jīng)前體細(xì)??胞向神經(jīng)元（ＴＵＪ１陽(yáng)性細(xì)胞）分化的比例明顯降低（圖１－５

?ＣｕＭｂ，、．’ｅ如林?Ｗ??結(jié)豁嘶凍糸氣??戶(hù)令々？片、＊?Ｖ氣處奪＊；；?Ｓ??Ｖ、令＇公：巧＼、Ｖ、？媒??圖１－８?小鼠腦中的ＧＦＡＰ陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)并無(wú)明顯改變。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－８?Ｔｈｅ?ＧＦＡＰ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ?過(guò)ｉｄ?ｎｏｔ?ｓｈｏｗ?ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ??ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ?ｃｈａｎｇｅ?ｉｎ?Ｃｗ／４々ａ化＂＂－Ｇｇ?ｍｉｃｅ．??隨后我們通過(guò)免疫姐化實(shí)驗(yàn)分析了打似６Ｗａ＂＂－〇ｅ及同窩對(duì)照小鼠前腦組織中??Ｓｌｏｏｐ陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果顯示，與野生型對(duì)照小鼠相比，仿／如Ｗｕ＂＂－ＣＶｅ小鼠??的皮層及海馬區(qū)域中Ｓｌｏｏｐ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量并無(wú)明顯改變（圖１－９）。??誦圓??圖＾９?Ｃ？／媒Ｗ６Ｗ＂－〇ｅ小鼠及同窩對(duì)照小鼠的前腦組織中Ｓｌｏｏｐ免疫沮織化學(xué)染色。??扔ｇｕｒｅ?１－９?Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ?ｏｆ?Ｓｌｏｏｐ?ｉｎ?化ｅ?ｆｏｒｅｂｒａｉｎｓ?ｏｆ?ａｎｄ??Ｉｈｔｅｒｍａｔｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｍｉｃｅ．??接下來(lái)我們分析了?ａ＜／飾敲除小鼠腦中神經(jīng)元的數(shù)量，對(duì)小鼠的皮層和海馬?．??３３??
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