發(fā)布時間：2020-10-10 09:09

　　 第一部分NMDA-R阻斷對少突膠質(zhì)細胞增殖、分化及成髓鞘的影響及其可能的機制探討實驗目的:探討N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體在少突膠質(zhì)細胞增殖、分化、成髓鞘中的作用及其可能的機制。實驗方法:以C57BL/6J小鼠原代少突膠質(zhì)細胞為研究對象,隨機分為對照組和MK-801處理組,運用CCK-8、EdU方法檢測細胞增殖情況,運用Western blot技術檢測Olig2、MBP蛋白表達以反映細胞分化和成髓鞘作用,運用qRT-PCR檢測NMDA-R亞基NR1、NR2A、NR2B、NR2C、NR2D、NR3A及NR3B的表達情況。實驗結(jié)果:CCK-8細胞活力結(jié)果顯示,NMDA-R阻斷劑MK-801呈濃度依賴性減少存活原代少突膠質(zhì)細胞數(shù)量,即隨著MK-801濃度增加,存活原代培養(yǎng)少突膠質(zhì)細胞數(shù)量逐漸減少;EdU細胞增殖結(jié)果顯示,10μmol/L MK-801作用48小時后,原代培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細胞增殖數(shù)量(32.9±8.47)%較對照組(42.4±7.35)%明顯減少(p=0.0154);Western blot結(jié)果顯示,與對照組(1.000±0.206)相比,MK-801處理后少突膠質(zhì)細胞Olig2蛋白表達顯著減少(0.794±0.167,p=0.0130.05);MK-801處理后少突膠質(zhì)細胞MBP蛋白表達也顯著減少(1.000±0.276 vs 0.650±0.237,p=0.0260.05);qRT-PCR結(jié)果顯示,MBP mRNA的表達在MK-801處理后也顯著降低(p0.01)。與對照組比較,MK-801處理組少突膠質(zhì)細胞NMDA-R亞基NR1亞基mRNA表達(1.04±0.29 vs 0.53±0.27,p=0.010.05)及蛋白表達(1.00±0.10 vs0.79±0.17,p=0.0160.05)均顯著降低,NR2A(1.00±0.27 vs 0.45±0.19,p=0.0050.05)、NR2B(1.00±0.15 vs 0.55±0.20,p=0.0040.05)及NR3A亞基(1.08±0.15 vs 0.79±0.25,p=0.0380.05)mRNA表達量亦明顯降低,但NR2C(p=0.519)、NR2D(p=0.230)、NR3B(p=0.164)mRNA表達水平?jīng)]有顯著性變化。實驗結(jié)論:NMDA-R阻斷劑MK-801對少突膠質(zhì)細胞的增殖、分化及成髓鞘均具有抑制作用,這種作用可能通過下調(diào)NR1、NR2A、NR2B、NR3A亞基來介導。第二部分抗精神病藥物通過NMDA-R調(diào)控少突膠質(zhì)細胞增殖及其可能的機制探討實驗目的:探討抗精神病藥物喹硫平、氟哌啶醇和利培酮對少突膠質(zhì)細胞增殖的影響及其通過改變NMDA-R亞基調(diào)控的可能機制,同時探討抗精神病藥物能否逆轉(zhuǎn)NMDA-R阻斷引發(fā)的細胞增殖減少。實驗方法:以C57BL/6J小鼠原代少突膠質(zhì)細胞為研究對象,隨機分為對照組、MK-801組、喹硫平(QUE)處理組、氟哌啶醇(HAL)處理組、利培酮(RIS)處理組及MK-801聯(lián)合QUE處理組、MK-801聯(lián)合HAL處理組和MK-801聯(lián)合RIS處理組,運用CCK-8、Ed U方法檢測細胞增殖情況,運用q RT-PCR檢測NMDA-R亞基NR1、NR2A、NR2B、NR2C、NR2D、NR3A及NR3B的表達情況。實驗結(jié)果:CCK-8細胞活力結(jié)果顯示,與對照組相比,三種抗精神病藥物QUE、HAL和RIS均能夠增加存活原代少突膠質(zhì)細胞數(shù)量;但Ed U結(jié)果顯示,與對照組Ed U陽性細胞(39.95±9.05)%相比,QUE組Ed U陽性細胞為(46.90±8.47)%,差別不具有顯著性;HAL組Ed U陽性細胞為(58.44±10.47)%,顯著高于對照組(p=0.0451);RIS組Ed U陽性細胞為(50.41±7.11)%,顯著高于對照組(p=0.049)。q RT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,QUE處理組中少突膠質(zhì)細胞NMDA-R的NR1亞基m RNA表達增高(p=0.002),而NR3A的表達降低(p=0.016);HAL處理組中細胞NMDA-R的NR1(p=0.007)、NR2A(p=0.001)、NR2B(p=0.012)和NR2C(p=0.007)m RNA表達增高,NR2D(p=0.025)亞基m RNA表達降低;RIS處理組中少突膠質(zhì)細胞NMDA-R的NR1(p=0.007)、NR2A(p=0.006)、NR2C(p=0.011)亞基m RNA水平增高;CCK-8結(jié)果顯示,三種抗精神病藥物QUE、HAL均能逆轉(zhuǎn)MK-801對少突膠質(zhì)細胞增殖的抑制作用。實驗結(jié)論:單獨使用喹硫平對少突膠質(zhì)細胞增殖無促進作用,但其可逆轉(zhuǎn)MK-801對少突膠質(zhì)細胞增殖的抑制作用,該作用可能通過調(diào)控NR1、NR3A亞基的表達來實現(xiàn);氟哌啶醇可促進原代培養(yǎng)少突膠質(zhì)細胞的增殖并可逆轉(zhuǎn)MK-801對少突膠質(zhì)細胞增殖的抑制作用,該作用可能與上調(diào)NR1、NR2A、NR2B、NR2C亞基的表達和下調(diào)NR2D亞基相關;RIS雖然不能逆轉(zhuǎn)MK-801對細胞增殖的抑制作用,但其發(fā)揮促進細胞增殖作用可能是通過上調(diào)NR1、NR2A、NR2C的表達來實現(xiàn)。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R749
【部分圖文】：

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文料的實驗結(jié)果以構成比表示。所有實驗均獨立重復至少 3 次，采用 Graphpism7 軟件制圖。研究結(jié)果1 少突膠質(zhì)細胞形態(tài)學觀察細胞培養(yǎng)方法為組織塊培養(yǎng)法，培養(yǎng) 48 小時后，可見大部分組織塊已貼壁細胞從組織塊爬出（如圖 2.1，A）。培養(yǎng) 4 天時，可見細胞融合 70%左右，細胞上層有胞體較圓較亮，突起較少的細胞為少突膠質(zhì)細胞前體細胞（如圖 2.；培養(yǎng) 7 天時，OPC 細胞更多，胞體較圓多為單極或雙極（如圖 2.1，C）細胞傳代純化之后繼續(xù)培養(yǎng)至 10-12 天，少突膠質(zhì)細胞突起更多（如圖 2.1，DA B

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文.2 少突膠質(zhì)細胞鑒定及純度為確保細胞培養(yǎng)所獲細胞為少突膠質(zhì)細胞譜系，本實驗以細胞形態(tài)及免疫標記對少突膠質(zhì)細胞進行了鑒定。光鏡下可見細胞胞體較圓，折光性強，突雙極或三極狀，為少突膠質(zhì)細胞典型形態(tài)。用少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄因子oligodendrocyte transcription factor 2，Olig2）標記少突膠質(zhì)細胞，DAPI 標記胞核。免疫熒光結(jié)果顯示（圖 2.2），Olig2+細胞占 DAPI+細胞數(shù)為（84.2±3.64）胞純度能夠達到實驗要求，可用于后續(xù)實驗檢測分析。DAPI Olig2A B

DAPI nucleus staining(blue), and the merge of both staining, scale bar=50 μm; D:percentage of Olig2-positive cells in cultured system 預先適量 L-谷氨酸對少突膠質(zhì)細胞的影響查閱文獻[42]，少突膠質(zhì)細胞在體外培養(yǎng)的條件下，由于谷氨酸的不足 NMD無功能狀態(tài)。因此實驗中預先給予 100 μmol/L 谷氨酸，每天刺激少突膠0 分鐘，并連續(xù)作用至少 3 天。10 μmol/L MK-801 作用 48h 后，CCK-8 檢測細胞活力，比較添加谷氨-801 對細胞的作用。結(jié)果顯示（圖 2.3），單獨使用 MK-801 時，與對照少突膠質(zhì)細胞增殖的抑制作用不明顯，僅在 100μmol /L 時存活細胞數(shù)量（p<0.05）。聯(lián)合谷氨酸作用，與對照組（0 μmol /L MK-801，100μm酸）相比，細胞活性與 MK-801 濃度成負相關，10-100μmol /L 時抑制作著性差異（*：p<0.05,**:p<0.01)。

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本文編號：2835008