阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種多發(fā)于老年期和老年前期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其主要病理學(xué)改變包括彌漫性大腦萎縮、β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques, SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)和大量的神經(jīng)元丟失。伴隨社會老齡化的進程,AD的發(fā)病率逐年上升,已成為嚴重危害人類健康的醫(yī)學(xué)和社會問題。目前AD的病因和發(fā)病機制尚不十分清楚。研究表明,多種因素所導(dǎo)致的小膠質(zhì)細胞激活引發(fā)的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)在AD的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。而補體系統(tǒng)作為機體體液免疫的重要部分,也參與上述炎性反應(yīng)過程。在AD患者大腦中,研究者發(fā)現(xiàn)補體經(jīng)典途徑早期成分C1、C2、C4等和補體活化最終形成的攻膜復(fù)合體(Membrane attack complex,MAC)的表達上調(diào)。除經(jīng)典途徑外,Strohmeyer等發(fā)現(xiàn)補體的替代通路也與AD的病理損害相關(guān),免疫組化顯示在AD患者大腦中替代通路關(guān)鍵因子B因子及D因子的存在。另外,較弱證據(jù)支持甘露聚糖結(jié)合凝集素(Mannan binding lectin,MBL)途徑也參與其中,Lanzrein等發(fā)現(xiàn)在AD與對照組血清中,MBL并未有顯著差異,但是在腦脊液中,AD患者MBL卻有明顯降低。 然而補體各成分在AD發(fā)病過程所起作用目前仍不甚清楚。近年來對補體C1q的研究發(fā)現(xiàn)其可能起多種作用。部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)其有毒性作用：報道稱Clq通過與Ap多價結(jié)合,參與老年斑的成核過程。國內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)C1q可能是導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元氧化毒性及神經(jīng)元死亡的因素之一。而部分學(xué)者則認為C1q有神經(jīng)保護作用：Pisalyaput等通過體外實驗證實C1q可以增強小膠質(zhì)細胞吞噬Aβ,并且可以保護神經(jīng)元細胞免受Aβ所致神經(jīng)毒性。另外,有研究發(fā)現(xiàn)其能夠抑制Ap和血清P蛋白所致的神經(jīng)毒性。近來Deborah等則發(fā)現(xiàn)它還有利于小膠質(zhì)細胞吞噬凋亡的神經(jīng)元以及調(diào)節(jié)而后的炎性反應(yīng)。 然而,除此之外,補體C1q是否促進小膠質(zhì)細胞所主導(dǎo)的顱內(nèi)慢性炎性反應(yīng)呢?這是可能的,因為補體C1q可能促進Aβ與小膠質(zhì)細胞的結(jié)合。首先,補體Clq既能與Ap結(jié)合(如上文所述),又能與小膠質(zhì)細胞結(jié)合�，F(xiàn)已有人證實小膠質(zhì)細胞上存在C1q的受體C1qR。其次,補體Clq、Aβ與小膠質(zhì)細胞等三者在AD患者腦組織中位置上很接近。免疫組化顯示老年斑周圍也即沉積的Ap纖維周圍存在活化的小膠質(zhì)細胞和補體Clq。那么,補體C1q就有可能通過與Aβ和小膠質(zhì)細胞的相互結(jié)合促進后兩者的結(jié)合,從而促進小膠質(zhì)細胞的活化以及而后的炎性反應(yīng)。 我們的研究采用不濃度C1q和同一濃度Ap纖維刺激BV-2細胞,并且利用C1qA(可以競爭性與Aβ的結(jié)合)進行阻斷試驗,最終測定BV-2細胞的活化程度—CD45的表達以及炎性因子TNF-α、IL-6蛋白及mRNA的表達水平。BV-2細胞CD45的表達采用流式細胞技術(shù);TNF-α、IL-6蛋白濃度采用ELISA技術(shù),方法參照TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒內(nèi)所附的操作說明；TNF-α、IL-6的mRNA測定采用定量PCR技術(shù),方法參照相應(yīng)定量PCR說明書進行。檢測結(jié)果顯示,補體C1q上調(diào)了BV-2細胞CD45的表達,增加了TNF-α蛋白及其mRNA的表達,而IL-6在加入補體C1q后無顯著性變化。 [材料和方法] 1.材料 BV-2小膠質(zhì)細胞購自于中國科學(xué)院上海細胞庫；淀粉樣蛋白Aβ1-40(美國Sigma公司)；補體C1q(以色列Prospec公司)；補體C1qA(中國臺灣Abnova公司)；CCK-8試劑(日本株式會社同仁化學(xué)研究所)；IL-6和TNF-α的ELISA試劑盒(奧地利Bender公司)；NP40(美國Cayman公司)；定量PCR試劑盒(美國復(fù)能基因公司)。 2.方法 2.1 BV-2細胞的培養(yǎng)BV—2細胞在37℃水浴后,經(jīng)1000rpm離心5分鐘去除凍存液,然后置入25cm2培養(yǎng)瓶,在37℃、5%C02條件下,用含10%FCS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,待細胞生長至80%-90%融合時傳代。 2.2聚集狀態(tài)Aβ1-40的制備與鑒定用無菌去離子水將Aβ1-40稀釋成lmg/mL,37℃孵育7天,使其變?yōu)槔w絲狀聚集的Aβ。然后取5μl上述液體滴于含碳支持膜200目去離子銅網(wǎng)上,空氣干燥1分鐘后,用2%醋酸雙氧鈾負染1分鐘,使用透射電鏡觀察。 2.3細胞存活率測定重懸培養(yǎng)瓶中BV-2小膠質(zhì)細胞,以5×105/ml接種于96孔培養(yǎng)板中,分為7個實驗組、1個陽性對照組和1個空白組,每組含3孔,繼續(xù)培養(yǎng)12h后,各實驗組分別加入陽性對照組脂多糖LPS(1μg/L),實驗組Aβ1-40(100mg/L),C1q (10nmol/L), C1q (50nmol/L),Aβ1-40 (100mg/L)+C1q (10nmol/L),Aβ1-40 (100mg/L)+C1q (50nmol/L),Aβ1-40 (100mg/L)+C1q (10nmol/L)+C1qA (10nmol/L), Aβ1-40 (100mg/L)+C1q (50nmol/L) +C1qA(50nmol/L),空白組則不加(其中含有兩個藥物及以上的組加藥前先將所加藥物混合,并在37℃下孵育1h),培養(yǎng)24 h后去除上清夜,加入100μl含有10%CCK-8的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)2h,最后用酶標儀在450nm波長下測每一孔的吸光度,按公式計算出各孔細胞存活率。 2.4各實驗組BV-2細胞CD45表達測定在6孔板中重復(fù)進行上述處理過程,培養(yǎng)24 h后吸除上清液并加入0.25%胰酶消化細胞,待消化完吸除胰酶,加入1ml預(yù)冷PBS液使細胞重懸,然后移至1.5ml離心管中,2000rpm離心5min,吸除上清后再加入200μl PBS液重懸細胞,仍2000rpm離心5min,并重復(fù)兩次,然后用100μl PBS重懸細胞,并在加入2μl大鼠抗小鼠CD45流式抗體,混勻至4℃冰箱孵育30min,然后按上述過程用PBS再清洗細胞3次后使用流式細胞儀測定表達CD45的BV-2細胞數(shù)量。 2.5各實驗組上清液及細胞裂解液IL-6、TNF-α的測定在24孔板中重復(fù)進行上述處理過程,培養(yǎng)24 h后吸取上清液并儲存于-20℃冰箱中,然后用PBS清洗孔內(nèi)細胞,并在清洗后向每孔加入200μl含0.5%NP40的PBS液裂解細胞,最后將細胞裂解液離心后取上清也置于-20℃冰箱中保存。檢測時將所有標本從冰箱中取出,融化后將所有標本經(jīng)3000rpm離心20分鐘,余步驟按ELLISA試劑盒說明書進行,最后用酶標儀在450nm波長下測吸光度(A)值,繪制標準曲線,根據(jù)曲線計算IL-6、TNF-α的濃度。 2.6各實驗組IL-6、TNF-α的mRNA測定在6孔板中重復(fù)進行上述處理過程,培養(yǎng)24 h后吸除上清液,利用TRIZOL法提取總RNA并測定RNA濃度,余實驗按復(fù)能公司提供的定量PCR試劑盒說明書進行。 3.統(tǒng)計學(xué)分析 計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法,方差齊性用LSD法進行組間多重比較,方差不齊用Dunnett's T3法進行組間多重比較。P0.05被定為有統(tǒng)計學(xué)差異。 [結(jié)果] 1.各組BV-2細胞細胞存活率比較結(jié)果 各實驗組BV-2小膠質(zhì)細胞細胞存活率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.020,P=0.103)。 2.各組BV-2細胞CD45表達比較結(jié)果 流式細胞術(shù)檢測到各組均有不同數(shù)量BV-2小膠質(zhì)細胞表達CD45。各實驗組BV-2小膠質(zhì)細胞表達CD45數(shù)量有顯著性差異(F=59.031,P=0.000)。其中,經(jīng)LPS(1μg/L)處理后,BV-2小膠質(zhì)細胞表達CD45的數(shù)目較其他各組增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；另經(jīng)Aβ1-40 (100mg/L)+C1q (50nmol/L)處理后BV-2小膠質(zhì)細胞表達CD45的數(shù)量較LPS組外各組增加,較LPS組降低,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3.各組上清液及細胞裂解液中IL-6、TNF-α濃度比較結(jié)果 3.1各組上清液及細胞裂解液中IL-6濃度的測定值：各實驗組上清液及細胞裂解液中IL-6濃度比較差異具有統(tǒng)計意義(上清液IL-6濃度比較F=77.838,P=0.000；細胞裂解液中IL-6濃度比較F=24.038,P=0.000)。其中經(jīng)LPS處理后,BV-2細胞上清液及細胞裂解液中測得的IL-6濃度較與其余各組相比明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其余各組上清液及細胞裂解液中IL-6濃度相互比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3.2各組上清液及細胞裂解液中TNF-a濃度的測定值：各實驗組上清液及細胞裂解液中TNF-α濃度比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(上清液TNF-a濃度比較F=157.891,P=0.000；細胞裂解液中TNF-α濃度比較F=166.897,P=0.000)。其中經(jīng)LPS,BV-2小膠質(zhì)細胞上清液及其細胞裂解液中TNF-a濃度與其余各組相比增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。除此之外,經(jīng)Aβl-40(100mg/L)+C1q(50nmol/L)處理后,與除LPS外各組相比上清液中測得的TNF-a增加,較LPS組減少,其差異均具有有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4.各組IL-6、TNF-a的mRNA表達比較結(jié)果 4.1各組BV-2小膠質(zhì)細胞IL-6 mRNA表達水平：各實驗組IL-6 mRNA表達水平比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=66.743,P=0.000)。其中經(jīng)LPS處理后,BV-2小膠質(zhì)細胞IL-6 mRNA表達水平較其他組升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；而其他各組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05) 4.2各組BV-2小膠質(zhì)細胞TNF-αmRNA表達水平：各實驗組TNF-αmRNA表達水平比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=65.695,P=0.000)。其中經(jīng)LPS處理后,BV-2小膠質(zhì)細胞TNF-αmRNA表達水平較其他組升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；而經(jīng)Aβ1-40 (100mg/L)+C1q (50nmol/L)處理后,BV-2小膠質(zhì)細胞TNF-αmRNA表達水平較LPS組低,較其余各組升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05) [結(jié)論] 一、補體C1q增強Aβ對小膠質(zhì)細胞的活化作用。 二、補體C1q增強Aβ所致小膠質(zhì)細胞的炎性反應(yīng),即在補體Clq和AD共同干預(yù)下小膠質(zhì)細胞分泌TNF-a水平明顯增加。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

Fig.l一 1Differentformsofp一alnyloidl一40注:圖l一IA示A田一40單體，以無定形結(jié)構(gòu)存在，沒有明顯的聚集，電子密度較低，未見纖維結(jié)構(gòu)形成;圖1一lB示A印一40纖維體，以淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)為主，縱橫交錯，呈針狀或晶狀聚集。3、討論目前己有很多關(guān)于Ap的聚集狀態(tài)與它們神經(jīng)毒性作用的研究，并且指出可溶性的寡聚體可能具有較強的毒性作用。但關(guān)于Ap的聚集狀態(tài)與它們活化小膠質(zhì)細胞能力的研究卻很少，且沒有取得一致意見。有研究指出，只有聚集程度較高的Ap纖維才能刺激小膠質(zhì)細胞的活化，引起炎癥因子、過氧化氫釋放和小膠質(zhì)的增殖[’8]。另外有報道【’9，20項」認為是分子量較小的Ap寡聚體而不是分子量較大的Ap纖維介導(dǎo)了小膠質(zhì)細胞的活化，并提供了相關(guān)的實驗證據(jù)。White等[20]對兩種聚集形式的Ap與星形膠質(zhì)細胞的作用進行研究后指出:兩種形式的Ap在AD的發(fā)展過程中都有重要的作用，寡聚體在發(fā)病的早期階段起主要的作用，而纖維形式的Ap則在維持AD患者腦內(nèi)持久的炎癥反應(yīng)中有重要作用。另外有些研究則認為單獨Ap刺激小膠質(zhì)細胞的炎性反應(yīng)不強

(p<0.05):而經(jīng)Apl一40(loomg幾)+Clq(sonmol/L)處理后，BV-2小膠質(zhì)細胞TNF一 an1RNA表達水平較LPS組_低，較其余各組升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2一4，圖2一ZB);2.5各組BV-2小膠質(zhì)細胞IL一 6mRNA表達水平:各實驗組IL一 6n1RNA表達水平比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=66.743，P=0.000)。其中經(jīng)LPS處理后，BV-2小膠質(zhì)細胞IL一 6mRNA表達水平較其他組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而其他各組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2一4，圖2一Zc)。表2一 3Bv-2小膠質(zhì)細胞的細胞存活率及TNF一。、IL一6的分泌水平(pg/ml)TableZ一 3BV-2mierogliaeellviability(%)andthesecretionlevelsofTNF一 aandIL一6.(Pg/ml)組細胞存活率TNF一a濃度 (Pg/ml)IL一6濃度(p留ml)別(%)上清液細胞裂解液上清液細胞裂解液 A100，00土 0123，74土11.27#△28.81土 236525.18土 25.8948.79土54.73 B10067土2.31128刀9土4.23#△36.29土 14.688.67土 13912.08土20.92 C98.67土0.58137.15土7.41#△12.78土 3448.80土 069157.61土91.91 D97.67土1.15132.32土11.58#△45.51土 24.6126.52土 24.9086.46土78.66 E98.33土1.53189.17土6，80#△102

圖3一1流式細胞術(shù)檢測不同組BV-2細胞表達CD45變化Fig3一1DeteetionofCD45indiffereniBV-2grouPsbyflowcytometry注:①流式細胞儀進行時所設(shè)定的“門”，即進行檢測的所有細胞;A組一正常對照組;B組一Apl一40(100mg幾);C組一Clq(10nmol幾);D組一Clq(50nmol幾);E組一Apl一40(100mg/L)+Clq(10nmol幾);F組一Apl一40(100mg幾)+Clq(50nmol/L);G組一Apl一40(loomg幾)+Clq(10nmo比)+ClqA(lonmo比);H組一Apl一40(100mg幾)+Clq(50nmoVL)+ClqA(50nmol幾);I組一LPS(l卜g幾)。26

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2833027