發(fā)布時間：2020-09-30 12:07

　　 背景:神經(jīng)元大量丟失是阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)中的一個重要病理變化,而凋亡是神經(jīng)元死亡的主要形式。SET是PP2A的內(nèi)源性抑制劑,廣泛分布于大腦的各個區(qū)域,并主要定位于細胞核內(nèi)。在AD腦中,SET的表達水平顯著增加,導(dǎo)致PP2A活性下降,引起tau的異常過度磷酸化,是AD發(fā)病的關(guān)鍵因素。有研究表明,SET與神經(jīng)元的凋亡相關(guān),并且SET對細胞凋亡的影響與其在胞漿中的水平相關(guān)。AD腦中SET的定位也發(fā)生改變,由胞核轉(zhuǎn)移至胞漿,我們前期研究中通過對SET核定位信號序列的研究發(fā)現(xiàn)SET Ser-9位點發(fā)生磷酸化會導(dǎo)致SET的核定位信號失活,引起SET滯留于胞漿中,而用Ser-9位點特異性的磷酸化抗體檢測也確定了AD腦中SET在該位點的磷酸化水平顯著增加。SET作為PP2A的特異、高效的內(nèi)源性抑制劑,通過抑制PP2A的去磷酸化作用,參與了細胞內(nèi)許多分子活性的調(diào)節(jié),包括與細胞生存相關(guān)的p53,Akt等激酶活性的調(diào)節(jié)。NM23-H1是一個代謝抑制因子,它具有DNA酶活性,能夠剪切DNA造成DNA損傷,引起凋亡,同時它也是p53的正調(diào)節(jié)因子,能夠通過上調(diào)p53活性促進凋亡的發(fā)生。正常情況下,SET能夠與NM23-H1組成復(fù)合物,在應(yīng)激條件下,NM23-H1與SET發(fā)生解離,游離的NM23-H1就會入核,剪切DNA引起細胞凋亡。有研究表明Tau蛋白尤其是非磷酸化的tau能夠與DNA結(jié)合,具有保護DNA雙鏈的完整性的作用,而SET介導(dǎo)的tau蛋白異常過度磷酸化是否影響tau對DNA的保護作用仍不清楚。這些研究提示,磷酸化的SET可能參與神經(jīng)元凋亡的過程,但具體機制不明。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)過表達磷酸化的SET會導(dǎo)致SET滯留于胞漿中,導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡。通過在HEK293/tau細胞中的研究發(fā)現(xiàn),磷酸化的SET對PP2A的抑制作用比野生型SET更加顯著,引起p53的過度磷酸化,導(dǎo)致P53的過度激活,進一步引起B(yǎng)ax/Bcl-2的比值升高,激活caspase 3。而磷酸化的SET并沒有引起Akt的活性增加。另外,磷酸化的SET還導(dǎo)致了NM23-H1從SET/NM23-H1復(fù)合體中被釋放,使其從胞漿轉(zhuǎn)移到胞核,一方面作為P53的正調(diào)因子進一步激活p53,一方面直接發(fā)揮其DNA酶活性,引起DNA損傷。同時,磷酸化的SET還引起了胞核中總tau和非磷酸化的tau的減少,使其對DNA的保護作用發(fā)生障礙。本研究證實,磷酸化的SET通過介導(dǎo)P53的過度活化及NM23-H1入核和核tau減少引起的DNA損傷引起細胞凋亡的發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)表明,磷酸化的SET參與了AD中神經(jīng)元的凋亡發(fā)生,并探討了其引起細胞凋亡的新機制,為AD治療靶點的選擇提供一個新思路。目的:明確磷酸化SET對神經(jīng)元凋亡的影響,探討其引起細胞凋亡的潛在分子機制,為AD藥物的開發(fā)提供新思路。方法:利用基因定點突變將SET的第9位絲氨酸位點(Ser-9)突變?yōu)楸彼?模擬非磷酸化SET)和谷氨酸(模擬磷酸化SET),并構(gòu)建基因的質(zhì)粒表達載體以及腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)載體。體外培養(yǎng)大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人最長tau(tau441)基因的人胚腎細胞,即HEK293/tau細胞,并在其中過表達SET野生型及其突變體,利用流式細胞術(shù)及TUNEL(Td T介導(dǎo)的d UTP缺口末端標記技術(shù))法檢測神經(jīng)元及HEK293/tau細胞的凋亡情況。在HEK293/tau細胞中,利用激光共聚焦技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后SET的亞細胞定位和caspase-3激活情況,利用PP2A活性檢測試劑盒檢測PP2A的活性及western blotting檢測Y307位點磷酸化的PP2A(PP2A的非活性狀態(tài))水平明確磷酸化SET對PP2A活性的影響。利用激光共聚焦和免疫共沉淀的方法檢測了磷酸化SET與PP2A的催化亞單位PP2Ac的結(jié)合情況,探討磷酸化SET對PP2A活性影響的機制。通過免疫熒光觀察了轉(zhuǎn)染磷酸化SET后細胞凋亡執(zhí)行相關(guān)蛋白caspase 3的活化形式——剪切的caspase 3(cleaved caspase 3)的水平及細胞核的形態(tài)變化,利用western blotting檢測了cleaved caspase 3的水平,相關(guān)激酶p53的磷酸化及其下游Bax,Bcl-2的水平,Akt及其下游GSK-3β的磷酸化水平。同時,為了檢測過表達磷酸化SET對SET與NM23-H1結(jié)合及NM23-H1的核漿分布的影響,采用免疫共沉淀方法檢測NM23-H1與SET的結(jié)合,分離胞漿胞核蛋白,通過western blotting檢測胞漿胞核中NM23-H1的水平變化,及轉(zhuǎn)染后胞漿胞核中總tau及非磷酸化tau的變化,同時通過用彗星實驗(comet assay)檢測DNA的損傷情況。結(jié)果:在大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元及HEK293/tau細胞株中,分別過表達SET及其突變體后,發(fā)現(xiàn)磷酸化的SET引起了神經(jīng)元和HEK293/tau細胞的凋亡和DNA斷裂。在HEK293/tau細胞中,磷酸化的SET在胞漿中聚集,引起了caspase 3活化增加,細胞核固縮。檢測PP2A活性發(fā)現(xiàn),過表達磷酸化的SET后,PP2A的活性比野生型進一步下降,其活性抑制相關(guān)位點Y307的磷酸化增加,進一步研究發(fā)現(xiàn)過表達磷酸化SET后,其定位于胞漿中,與PP2A的催化亞單位PP2Ac共定位增加,免疫共沉淀也證實磷酸化的SET與PP2Ac的結(jié)合較野生型SET增加。western blotting發(fā)現(xiàn)野生型的SET及磷酸化SET都能使p53這一促凋亡因子的活性形式絲氨酸Ser-46位磷酸化的p53水平增加,而磷酸化SET引起的p53磷酸化水平增加較野生型SET更為顯著,并且p53下游介導(dǎo)凋亡的分子Bax及Bcl-2的比值也增加,而對另一促進細胞生存的激酶Akt的活化形式-絲氨酸Ser-473位點磷酸化的Akt水平及其下游GSK3β的磷酸化水平的檢測發(fā)現(xiàn)野生型SET可以明顯增加Akt的活性,而磷酸化的SET對Akt的活性無顯著影響。免疫沉淀和western blotting發(fā)現(xiàn)過表達磷酸化SET后NM23-H1與SET結(jié)合減少,且NM23-H1在胞漿中的分布減少,在核內(nèi)分布增加,檢測總tau和非磷酸化tau的分布也發(fā)現(xiàn)核內(nèi)的總tau和非磷酸化tau均減少,同時彗星實驗也發(fā)現(xiàn)過表達磷酸化SET后DNA碎片化增加。結(jié)論:磷酸化的SET可以引起原代神經(jīng)元及HEK293/tau細胞發(fā)生凋亡,磷酸化SET一方面通過增強對PP2A活性的抑制,使p53的46位絲氨酸(Ser-46)磷酸化增加的而過度活化,促進p53的促凋亡作用,引起B(yǎng)ax/Bcl-2比值增加,caspase 3活化增加,另一方面通過釋放NM23-H1入核剪切DNA及破壞tau對DNA的保護作用進一步促進凋亡發(fā)生。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文細胞色素 c 的釋放，激活 caspase-9 然后進一步激活 caspase-3，最終導(dǎo)致細胞死亡[116-18]。相反的，內(nèi)部凋亡途徑（線粒體途徑），是由發(fā)育信號或細胞毒素刺激激活獨立于 caspase-8 和 Fas 相關(guān)死亡域蛋白（FADD）。線粒體的完整性能夠維持促凋和抗凋亡（Bcl-2 家族成員）分子之間的平衡[6]。內(nèi)部途徑同樣也會刺激釋放細胞素-C，然后與外部途徑重合，最終激活 caspase-3[13, 16, 19]。

68.Aβ 神經(jīng)毒性在阿爾茨海默病中的細胞路徑[75]。Aβ 與幾種不同的神經(jīng)元細體相互作用，并激活小膠質(zhì)細胞，觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)導(dǎo)致半胱天冬酶激活，成和 Ca2 +內(nèi)流。 細胞內(nèi) Ca2 +濃度增加可能激活 calpain，反過來激活半胱天u 蛋白激酶 Cdk5，導(dǎo)致神經(jīng)原纖維纏結(jié)、凋亡和神經(jīng)退行性變。道發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激及熱應(yīng)激時，核 tau 水平水增加，保護細胞不發(fā)生凋亡，但時，即使沒有外界應(yīng)激的情況下，細胞仍然發(fā)生凋亡，提示 tau 對 DNA 的亡中的重要作用[84]。

圖 3. 核 tau 對基因的保護作用[85]。3、早老蛋白早老蛋白 1 和早老蛋白 2 突變是早發(fā)型家族性阿爾茨海默病的主要原因[86]。老素是 Aβ 產(chǎn)生所必須的，其突變增加 Aβ42 產(chǎn)生，早老素突變可能增加神經(jīng)元對亡的易感性[87, 88]。4、載脂蛋白 Eε4 等位基因的遺傳是 60 歲以后阿爾茨海默病最常見的已知遺傳風險因素[89]。等位基因促進 Aβ 聚合成斑塊，可能會損害神經(jīng)元再生或促進氧化應(yīng)激[89, 90]。但些機制是否參與阿爾茨海默病中神經(jīng)元細胞死亡仍不能確定。四、阿爾茨海默病中凋亡機制研究的展望

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本文編號：2830824