第一部分Tacrine,memantine和bis(7)-tacrine對培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元NMDA電流抑制作用比較 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)發(fā)病機制與膽堿能神經(jīng)元功能缺損以及神經(jīng)元凋亡均有密切關(guān)系。在治療AD,特別是防止AD及其它神經(jīng)退行性病變方面,兼具抗凋亡作用的乙酰膽堿酯酶抑制劑如bis(7)-tacrine將會比單純的乙酰膽堿酯酶抑制劑發(fā)揮更有效的作用。本實驗通過膜片鉗技術(shù),利用原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元,將bis(7)-tacrine與tacrine和memantine對N-methyl-D-aspartate(NMDA)電流的抑制作用做比較,并進一步研究bis(7)-tacrinec對NMDA受體的作用機制。結(jié)果顯示,三種藥物均選擇性地作用于NMDA受體,濃度依賴性地抑制NMDA電流,其IC50值分別為3.61±0.78μM,112.33±19.83μM和8.82±1.03μM。Tacrine和memantine均為“開放通道阻滯劑”,作用于NMDA受體通道的內(nèi)部,表現(xiàn)為“激動劑依賴性”和“電壓依賴性”;前者與NMDA受體結(jié)合與解離的速度更快,25μM以上濃度tacrine與NMDA同時作用時,停藥后產(chǎn)生一內(nèi)向延遲電流峰。而bis(7)-tacrine對NMDA電流的抑制作用不同于tacrine和memantine,提前1 s給藥能明顯提高bis(7)-tacrine的抑制作用,但提前更長時間(2-90 s)并無進一步抑制。在鉗制電壓-50至+50mV的范圍內(nèi),bis(7)-tacrine對NMDA電流的抑制率沒有變化,I-V曲線的翻轉(zhuǎn)電位也沒有改變。Bis(7)-tacrine沒有明顯改變NMDA的EC50值[49.48±2.93μM in the absence of bis(7)-tacrine vs 57.32±8.43μM in the presence of bis(7)-tacrine;ANOVA,P㧐0.05;n = 7-8],但使NMDA最大反應(yīng)濃度(Emax)降低了約40%(ANOVA,P㩳0.05;n = 7-8),顯示bis(7)-tacrine的作用為非競爭性地抑制NMDA激活電流。結(jié)果提示,作為一種新型二聚體膽堿酯酶抑制劑,bis(7)-tacrine對NMDA激活電流的的抑制作用強于tacrine和memantine,其作用機制也與它們不同,是以慢作用方式、非競爭性地抑制NMDA激活電流,其臨床使用的效能和安全性可能較高。 第二部分Bis(7)-tacrine對培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體可能的作用位點研究 最近的研究證實,bis(7)-tacrine除作為一種乙酰膽堿酯酶抑制劑外,還可通過抑制原代培養(yǎng)大鼠小腦顆粒細胞NMDA受體而防止谷氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡。本實驗通過全細胞膜片鉗記錄研究bis(7)-tacrine對原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體可能的作用位點。結(jié)果發(fā)現(xiàn),細胞外液中甘氨酸的濃度從0.1μM增加至10μM,細胞外液pH值從8.1改變到6.7,在細胞外液中加入二硫蘇糖醇(2 mM)、精胺(10μM)、鎂離子(10至100μM)或鋅離子(5至20μM)均不引起bis(7)-tacrine對NMDA電流抑制率的改變。電極內(nèi)液中加入25μM bis(7)-tacrine也未觀察到外加的2.5μM bis(7)-tacrine對30μM NMDA激活電流抑制率的改變(37±3% vs對照組36±4%,P㧐0.05;n = 4)。但是,2.5μM bis(7)-tacrine及5μM dizocilpine(MK-801)分別對30μM NMDA激活電流抑制了36%和22%,而在兩種藥物都存在的條件下,30μM NMDA電流僅被抑制了37%。結(jié)果提示, bis(7)-tacrine雖然不大可能作用于MK-801位點,但MK-801卻可以負性調(diào)制bis(7)-tacrine對NMDA受體的抑制作用。 第三部分Bis(7)-tacrine對表達NR1/NR2A或NR1/NR2B受體的HEK-293細胞NMDA電流抑制作用 在正常大鼠前腦,NMDA受體復(fù)合物的構(gòu)成形式主要是NR1/NR2A和NR1/NR2B的二合體形式,少部分以NR1/NR2A/NR2B的三合體形式存在。因此,我們進一步通過表達NR1/NR2A或NR1/NR2B受體到培養(yǎng)的HEK-293細胞,利用膜片鉗技術(shù)來研究bis(7)-tacrine對NMDA電流的抑制作用。結(jié)果顯示,在同時給藥的情況下,作用于表達了NR1/NR2A受體的HEK-293細胞時,1μM bis(7)-tacrine對30μM NMDA和1000μM NMDA激活穩(wěn)態(tài)電流的抑制分別為46%和40%(ANOVA,P㧐0.05;n = 5),顯示其作用方式可能與NMDA濃度無關(guān),可能為非競爭性抑制;而作用于表達了NR1/NR2B受體的HEK-293細胞時,1μM bis(7)-tacrine對NMDA電流的抑制與NMDA濃度有關(guān),對30μM NMDA和1000μM NMDA激活穩(wěn)態(tài)電流的抑制分別為61%和13%(ANOVA,P㩳0.05;n = 6),這似乎是一種競爭性的作用方式。但在1000μM NMDA作用條件下,同時給予1μM bis(7)-tacrine對NMDA激活電流峰值產(chǎn)生了一定的抑制作用,電流逐漸下降到穩(wěn)態(tài),而在同一細胞上提前5秒給予1μM bis(7)-tacrine卻可以將峰值幾乎完全抑制。這一結(jié)果表明,bis(7)-tacrine對表達NR1/NR2B受體NMDA電流的抑制作用可能為慢作用方式,并不依賴于激動劑的存在。鉗制電壓從-50到+50mV變動范圍內(nèi),bis(7)-tacrine對NMDA電流的抑制率沒有發(fā)生變化,而且其翻轉(zhuǎn)電位沒有改變。這些結(jié)果與我們前面用培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元實驗結(jié)果趨于一致,證明bis(7)-tacrine作用于表達的NR1/NR2B受體時,還是以非競爭性方式,無激動劑依賴性和電壓依賴性,并且對離子的通透沒有發(fā)生選擇性變化。結(jié)果提示:在作用于表達了NR1/NR2A或NR1/NR2B的HEK-293細胞時,bis(7)-tacrine仍然以非競爭性方式抑制NMDA電流,可以此為模型進一步開展有關(guān)其分子機制的實驗研究。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R749.16

【參考文獻】

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本文編號：2822462