背景：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種發(fā)生于老年期或老年前期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD典型的病理特征為：神經(jīng)元內(nèi)纖維纏結(Neufibrillary tangles, NFTs)、細胞外老年斑(Senile plaques, SP)的形成,以及中樞膽堿能神經(jīng)元的大量死亡與丟失。β淀粉樣蛋白(amyloidβ, Aβ)被認為是AD病患者腦組織SP的最主要組成成分,它由β分泌酶和γ分泌酶裂解淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)產(chǎn)生。目前,AD發(fā)病機制還不是很清楚,但有研究顯示β淀粉樣蛋白(amyloidβ, Aβ)是各種因素誘發(fā)AD的共同通路,是AD形成和發(fā)展的關鍵因素。C反應蛋白(C reactive protein, CRP)是由炎癥或組織損傷引起的非特異的急性時相反應中最具代表性的標志物。目前越來越多的研究表明CRP可能參與AD的發(fā)病機制,并能惡化認知功能。但仍未有直接的證據(jù)證明CRP能導致AD認知障礙,并引起神經(jīng)化學物質(zhì)變化。 目的：為探討CRP對學習記憶及AD發(fā)病機制相關分子的影響,通過研究大鼠認知行為的影響及海馬和皮層中Aβ產(chǎn)生增多相關的分子(APP、PS-1、PS-2及BACE)和炎癥因子(CRP、IL-1β、IL-6及TNF-α)蛋白水平和基因水平的變化,以明確CRP能否介導大鼠學習記憶障礙及其可能機制。繼而從細胞水平進一步探索其可能的作用機制。采用PC12細胞為研究對象,系統(tǒng)地研究CRP對PC12細胞毒性作用及可能機制,為CRP成為治療AD的新靶點提供理論依據(jù)。 方法：(1)40只雄性Sprague-Dawley大鼠(220 g～250 g)隨機分為正常對照組、假手術組、CRP組和Aβ25-35組。采用雙側(cè)腦室立體定位(i.c.v.)注射給藥,CRP組和Aβ25-35組分別相應給予CRP(25.6μg/只)和Aβ25-35(10μg/只),假手術組給予等體積空白溶劑；手術14天后,采用Morris水迷宮進行定向航行實驗及空間探索實驗檢測其參照和空間學習記憶能力；在術后第20天采用避暗法檢測其長期記憶能力；行為學檢測后,采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(Real-time RT-PCR)和免疫印跡(Western blotting)方法檢測海馬和皮層組織中與“Aβ假說”分子機制相關分子(APP、PS-1、PS-2及BACE)及“神經(jīng)炎癥假說”分子機制相關炎癥因子(CRP、IL-1β、IL-6及TNF-α)的基因和蛋白表達水平變化。(2)CRP的細胞毒性實驗：體外培養(yǎng)PC12細胞,應用四甲基偶氮唑藍法(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)觀察不同濃度CRP對細胞活力的影響,并測定細胞外液乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)活力。(3)采用Real-time PCR和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)研究在亞毒性濃度下作用48小時,CRP濃度作用(1.25mg/L、2.5mg/L和5 mg/L)對Aβ生成增加相關基因(PS-1, PS-2, BACE-1和APP) mRNA表達和Aβ1-42表達的影響。(4)采用Real-time PCR和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)研究在亞毒性濃度下(5mg/L),CRP刺激后不同時間(12小時、24小時和48小時),PC12對Ap生成增加相關基因(PS-1, PS-2, BACE-1和APP) mRNA表達和Aβ1-42表達的影響。 結果：(1)在Morris水迷宮定向航行實驗中,游泳軌跡結果表明盡管在訓練初期大多數(shù)動物都是沿邊搜索方式,但正常組和假手術組比CRP組和Aβ組更快地學會直線搜索方式,導致顯著縮短潛伏期和游泳路程。實驗結果表明,在Day 1各組動物尋找平臺的潛伏期和所需游泳路程無顯著性差異(F=1.062,P=0.379和F=0.426,P=0.736)；其余四天各組動物尋找平臺的潛伏期有顯著性差異(分別為F=11.257,P=0.000；F=3.7、49,P=0.021；F=5.569,P=0.003和F=6.359,P=0.002),尋找平臺的所需游泳路程有顯著性差異(分別為F=7.658,P=0.001；F=5.925,P=0.002；F=5.421,P=0.004和F=5.780,P=0.003)。CRP組大鼠與假手術組大鼠比較,在Day 2、Day 4和Day 5尋找平臺的潛伏期有顯著性延長(分別為P=0.001；P=0.020和P=0.006),在Day 2、Day 3、Day 4和Day 5尋找平臺的所需游泳路程有顯著性延長(分別為P=0.001；P=0.039；P=0.027和P=0.035)；Aβ25-35組大鼠與假手術組大鼠比較,在Day 2、Day3、Day 4和Day 5尋找平臺的潛伏期有顯著性延長(分別為P=0.000；P=0.034；P=0.011和P=0.006),在Day 2、Day 3、Day 4和Day 5尋找平臺的所需游泳路程有顯著性延長(分別為P=0.001；P=0.002;P=0.011和P=0.026)；但正常組與假手術組相比無顯著性差異�？臻g探索實驗中,各組大鼠90秒內(nèi)游泳的總路程無顯著性差異(F=0.157,P=0.925),但各組大鼠90秒內(nèi)停留在原平臺所在象限(即目的象限)的探索時間和探索路程有顯著性差異(F=5.405,P=0.004；F=3.221,P=0.036)。與假手術組相比,CRP組和Ap組大鼠90秒內(nèi)停留在目的象限的探索時間明顯縮短(分別為P=0.048和P=0.019)；與假手術組相比, CRP組和Aβ25-35組大鼠90秒內(nèi)在目的象限探索路程明顯縮短(分別為P=0.044和P=0.032)；但正常組與假手術組相比均無顯著性差異。提示CRP組和Aβ25-35組大鼠的空間記憶能力損傷。在被動避暗實驗的適應訓練中,各組大鼠進入暗室的潛伏期無顯著性差異(F=0.115,P=0.951),表明各組大鼠間喜暗及鉆洞的習性無顯著性差異。在測試實驗中,各組大鼠進入暗室的潛伏期均有顯著性差異(F=6.870,P=0.001)。與假手術組相比,CRP組和Aβ25-35組大鼠均進入暗室的潛伏期明顯縮短(分別為P=0.002和P=0.025)；但正常組與假手術組相比均無顯著性差異。表明CRP組和Aβ25-35組大鼠的長期記憶受損。大鼠雙側(cè)i.c.v.注射后第22天,Real-time PCR結果顯示，與假手術組相比,CRP組能顯著提高在皮層組織中APP(P=0.031),IL-1β(P=0.000),IL-6(P=0.048),TNF-α(P=0,000),PS-1(P=0.035),PS-2(P=0.025)和內(nèi)源性CRP(P=0.002)mRNA表達和提高海馬組織中APP(P=0.019),IL-1β(P=0.000),IL-6(P=0.014),TNF-α(P=0.007)和內(nèi)源性CRP(P=0.002)mRNA表達；Ap組也能顯著提高在皮層組織中APP(P=0.013),IL-1β(P=0.000),IL-6(P=0.002),TNF-α(P=0.000),PS-1(P=0.033),PS-2(P=0.020)和內(nèi)源性CRP(P=0.000)mRNA表達和提高海馬組織中APP(P=0.004),IL-1β(P=0.000),IL-6(P=0.017),TNF-α(P=0.002)和內(nèi)源性CRP(P=0.035)mRNA表達。但正常組與假手術組相比均無顯著性差異。Western blotting結果表明,與假手術組相比,CRP組能顯著提高在皮層組織中APP(P=0.001),IL-1β(P=0.003)和IL-6(P=0.006)蛋白表達和提高海馬組織中IL-1β(P=0.000),BACE(P=0.000),TNF-α(P=0.000)和APP(P=0.000)蛋白表達；Aβ組也能顯著提高在皮層組織中APP(P=0.002),IL-1β(P=0.020)和IL-6(P=0.024)蛋白表達和提高海馬組織中IL-1β(P=0.000),BACE (P=0.000),TNF-α(P=0.000)和APP(P=0.000)蛋白表達。但正常組與假手術組相比無顯著性差異。(2)細胞實驗結果表明CRP對PC12細胞產(chǎn)生毒性作用,細胞存活率下降,LDH外漏增加,并且呈一定的劑量依賴性；當CRP濃度在12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L作用48小時后,與正常對照組比較,細胞存活率顯著下降(分別為P=0.000,P=0.001,P=0.003和P=0.003)；細胞LDH外漏顯著增加(分別為P=0.001,P=0.007,P=0.032和P=0.042)。(3)在亞毒性濃度下,CRP呈劑量依賴性地提高PS-1, PS-2, BACE-1和APP mRNA表達和Aβ1-42表達。不同濃度CRP (1.25 mg/L、2.5 mg/L和5 mg/L)能提高PC12細胞對PS-1, PS-2, BACE-1和APP mRNA表達及顯著提高Aβ1-42表達(分別為P=0.001,P=0.000和P=0.000),且呈一定的劑量依賴性；當CRP的濃度為5 mg/L時,PC12細胞對PS-1, PS-2, BACE-1和APP mRNA表達顯著上升(分別為P=0.000,P=0.000,P=0.000和P=0.000)。(4)CRP呈時間依賴性地提高PS-1, PS-2, BACE-1和APP mRNA表達和Aβ1-42表達。在亞毒性濃度(5 mg/L)下,CRP刺激后不同時間(12小時、24小時和48小時),PC12細胞PS-1, PS-2, BACE-1和APPmRNA表達升高,并顯著提高Aβ1-42表達(分別為P=0.026和P=0.001),且呈一定的時間依賴性；當5 mg/L CRP刺激48小時后,PC12細胞對PS-1, PS-2, BACE-1和APP mRNA表達顯著上升(分別為P=0.000,P=0.003,P=0.000和P=0.003),且BACE-1 mRNA表達在刺激24小時后也顯著上升(P=0.009)。 結論：i.c.v.注射CRP后能導致大鼠學習記憶障礙,推測其作用機制：一方面,可能通過上調(diào)APP, BACE和PS,進而導致內(nèi)源性的Aβ大量生成；另一方面,可能通過誘導神經(jīng)炎癥反應發(fā)生,從而導致一系列病理損傷,最終導致認知功能障礙；CRP對PC12細胞能產(chǎn)生明顯細胞毒性作用,且呈濃度依賴性,其作用機制通過上調(diào)APP, PS-1, PS-2和BACE-1的mRNA表達,進而大量生成內(nèi)源性的Ap,最終產(chǎn)生細胞毒性。CRP可能成為治療AD的一個新靶點。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

白一磷酸膽堿復合物結構圖(黃色為c擴十，綠色為磷酸膽5)strUetoreofC一reactiveProteineomPlexedwithPhosoftware(Aceelrys，SanDiego，CA)wasusedtogenerate.rayerystalstrUctureofCRP一PhosPhocholineeomPlexobteinDataBank(PDBentry1B09).Theealeiumionsare15green.為癡呆和AD的預測因子存在著矛盾結果，可能不同或樣本數(shù)不夠大等有關。一些研究認為CRP的預測因子121，221。大部分研究認為[l9，23，24]cRI，有關聯(lián)，可以預測癡呆和AD的進展。、恤noij。T多態(tài)性(與CRI，低水平相關)與癡呆和AD低風險發(fā)展中起作用。

圖8術后22天APPmRNA在皮層和海馬組織表達(無士SEM，n=3.8ThemRNAexPressionlevelsofAPPintheeerebraleortexandthehiPPoeambilaterallyi.e.v.injected22days.(萬士SEM，n=3)尸<0.05，P<0.01，eomParedwithNaivegrouP:#六0.05，##尸<0.01，eomparedwithvehiele腳up·600500400300200100...，，...，，『『~~~~~-，，卜卜二‘日日卜卜.-州州「「一門門...--州州卜卜‘--月月...一刁刁...，，卜卜=叫叫卜卜一-曰曰口口-111...~~~~~~~~，，...~~~~~~~~，，......卜卜一~-月月lll三國國卜卜--月月

本文編號：2820865