目的:血管性癡呆(vascular dementia, VD)由于各種腦血管病引起的獲得性認(rèn)知功能障礙,以學(xué)習(xí)、記憶功能缺損為主要癥狀,可伴有語(yǔ)言、運(yùn)動(dòng)、視空間及人格障礙等。隨著社會(huì)人口的日益老齡化和腦卒中治愈率的不斷提高,VD的發(fā)病呈迅速增長(zhǎng)趨勢(shì),成為神經(jīng)內(nèi)科的常見病、多發(fā)病,給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前VD的發(fā)病機(jī)制尚未明確,也無(wú)特效的防治方法,因此探討和闡明VD的發(fā)病機(jī)理,對(duì)于臨床制定更加合理的治療方案具有重要的價(jià)值和理論意義。 學(xué)習(xí)和記憶是大腦的高級(jí)功能之一。學(xué)習(xí)是指經(jīng)驗(yàn)及技能的獲得,記憶是經(jīng)驗(yàn)及技能的保存及再現(xiàn),它們是兩個(gè)不同而又密切聯(lián)系的神經(jīng)生物過(guò)程。目前認(rèn)為,海馬與學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)認(rèn)知功能密切相關(guān),其神經(jīng)元形態(tài)正常與否對(duì)學(xué)習(xí)、記憶的形成和維持具有重要意義�，F(xiàn)代大量資料研究證實(shí)海馬與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP)和學(xué)習(xí)、記憶過(guò)程密切相關(guān),人們稱LTP可能是“記憶的突觸模型”、“記憶的神經(jīng)元機(jī)制”。LTP形成后,動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力增強(qiáng);而通過(guò)受體阻斷劑阻抑LTP的產(chǎn)生,則影響動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力,記憶亦受損。而谷氨酸及其受體參與了LTP的產(chǎn)生與維持。 谷氨酸(Glutamate,Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),主要分布于大腦皮質(zhì)、海馬、小腦和紋狀體,在學(xué)習(xí)、記憶、突觸可塑性及大腦發(fā)育等方面均起重要作用。研究證實(shí),Glu的神經(jīng)遞質(zhì)作用是通過(guò)興奮性氨基酸受體而實(shí)現(xiàn)的,受體活性的變化、受體數(shù)目的增減都會(huì)對(duì)突觸效能產(chǎn)生明顯的影響。在對(duì)LTP的研究中,人們發(fā)現(xiàn)谷氨酸受體對(duì)LTP的誘導(dǎo)具有重要意義,這些受體的特異性拮抗劑不但可阻斷LTP的誘導(dǎo),而且可破壞多種學(xué)習(xí)和記憶行為。 神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(intracellular concentration of calcium,[Ca2+]i)、鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin dependent protein kinaseⅡ, CaMPKⅡ)及鈣調(diào)素(CaM)一直是腦組織缺血缺氧損傷機(jī)制研究的焦點(diǎn)。多種腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷难芯勘砻?神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載(Ca2+ over-loading)及CaMPKⅡ水平升高參與了腦組織缺血損傷;并且應(yīng)用Ca2+通道拮抗劑抑制鈣超載,可以減輕神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷。有些學(xué)者對(duì)缺血性腦組織損傷做了進(jìn)一步研究,發(fā)現(xiàn)缺血后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP- responsive element binding protein, CREB)水平升高,神經(jīng)突觸后膜谷氨酸受體表達(dá)增多,二者均參與了腦組織缺血性損傷。 目前認(rèn)為,在生理狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞[Ca2+]i是參與學(xué)習(xí)和記憶機(jī)制的細(xì)胞內(nèi)第二信使;CREB作為核內(nèi)的“第三信使”,具有調(diào)節(jié)包括學(xué)習(xí)記憶在內(nèi)的廣泛生物學(xué)的功能,是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的一種關(guān)鍵成分,而神經(jīng)細(xì)胞膜Glu受體N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazole propionic acid, AMPA)受體及細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i、CaM、CaMPKⅡ、CREB水平的變化對(duì)學(xué)習(xí)和記憶的影響,也逐漸成為了多數(shù)學(xué)者研究的熱點(diǎn)。也有學(xué)者對(duì)老年性癡呆(Alzheimers dementia, AD)動(dòng)物模型進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)AD模型腦組織內(nèi)鈣離子超載、谷氨酸受體水平降低。這些研究結(jié)果為我們探討VD動(dòng)物模型腦組織內(nèi)谷氨酸受體、鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及CREB改變提供了線索。 丁苯酞(dl-3n-butylphthalide,NBP)系從天然食用植物芹菜籽中提取并經(jīng)消旋合成的黃色油狀液體,具有芹菜香味。該藥為國(guó)家一類新藥,國(guó)外對(duì)該藥的研究尚未見報(bào)道,國(guó)內(nèi)馮亦璞等對(duì)丁苯酞治療腦缺血的相關(guān)機(jī)制做了大量的實(shí)驗(yàn)研究,發(fā)現(xiàn)丁苯酞具有多靶點(diǎn)抗腦缺血作用,能改善線粒體功能,提高腦血管內(nèi)皮NO和PGI2的水平,抑制谷氨酸釋放,降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和花生四烯酸含量,抑制自由基和提高抗氧化酶活性,減輕腦缺血所致腦水腫,抗血栓形成和抗血小板聚集,縮小腦梗死面積,改善局部腦血流量和細(xì)胞能量代謝、神經(jīng)功能缺失及腦缺血記憶障礙。但該藥對(duì)VD的實(shí)驗(yàn)研究尚未見相關(guān)報(bào)道�；诖�,本文通過(guò)探討谷氨酸受體及鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,觀察丁苯酞治療VD的效果并探討其作用機(jī)制。 方法:1采用三次雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎,造成腦組織反復(fù)缺血/再灌注,建立了小鼠VD模型,建立假手術(shù)組排除手術(shù)本身對(duì)小鼠所致的影響,通過(guò)跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)測(cè)試,觀察其行為學(xué)改變;用HE染色觀察海馬病理學(xué)特征變化。2采用免疫組化和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法測(cè)定各組小鼠海馬谷氨酸AMPA-GluR2蛋白及GluR2 mRNA的變化。3采用免疫組化和RT-PCR方法測(cè)定各組小鼠海馬谷氨酸NMDA-NR2B蛋白及NR2B mRNA的變化。4采用流式細(xì)胞分析技術(shù)測(cè)定各組小鼠海馬細(xì)胞[Ca2+]i變化;Western-Blot及RT-PCR方法檢測(cè)CaMPKII蛋白及mRNA表達(dá)的變化。5 Western-Blot及RT-PCR方法檢測(cè)CREB蛋白及mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果: 1 VD小鼠模型的行為學(xué)評(píng)價(jià)及海馬病理學(xué)特征 3月齡雄性昆明小鼠196只,分為假手術(shù)對(duì)照組、VD模型組、丁苯酞預(yù)防治療組、丁苯酞治療組。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎,連續(xù)三次腦缺血(20 min)再灌注(10min),建立VD小鼠模型。術(shù)后29d,各組分別進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn),測(cè)試學(xué)習(xí)成績(jī);術(shù)后30d測(cè)試記憶成績(jī),HE染色觀察各組小鼠海馬組織病理學(xué)特征。 1.1學(xué)習(xí)成績(jī) 術(shù)后第29天,分別進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn),測(cè)試跳臺(tái)試驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number/5 min)作為學(xué)習(xí)成績(jī),水迷宮試驗(yàn)游完全程時(shí)間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number/3 min)作為學(xué)習(xí)成績(jī)。 跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果顯示:⑴與假手術(shù)對(duì)照組的反應(yīng)時(shí)間(48.76±9.24)s比較,VD模型組小鼠學(xué)習(xí)階段的反應(yīng)時(shí)間(89.41±12.08)s明顯延長(zhǎng)(P0.01);⑵與VD模型組的反應(yīng)時(shí)間比較,丁苯酞治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的反應(yīng)時(shí)間(59.68±10.27)s及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的的反應(yīng)時(shí)間(57.23±10.05)s均明顯縮短(P0.01);⑶與假手術(shù)對(duì)照組的錯(cuò)誤次數(shù)(1.23±0.27)比較,VD模型組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(3.74±0.42)明顯增加(P0.01);⑷與VD模型組的錯(cuò)誤次數(shù)比較,丁苯酞治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(1.52±0.38)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的的錯(cuò)誤次數(shù)(1.48±0.31)均明顯減少(P0.01);⑸假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞治療組、丁苯酞預(yù)防治療組之間的學(xué)習(xí)成績(jī)無(wú)顯著性差異(P0.05)。 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示:⑴與假手術(shù)對(duì)照組的游全程時(shí)間(87.32±13.46)s比較,VD模型組小鼠學(xué)習(xí)階段的游全程時(shí)間(145.80±13.29)s明顯延長(zhǎng)(P0.01);⑵與VD模型組的游全程時(shí)間比較,丁苯酞治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的游全程時(shí)間(101.89±18.38)s及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的游全程時(shí)間(99.18±11.25)s明顯縮短(P0.01);⑶與假手術(shù)對(duì)照組的錯(cuò)誤次數(shù)(16.88±4.19)比較,模型組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(34.60±5.92)明顯增多(P0.01);⑷與VD模型組的錯(cuò)誤次數(shù)比較,丁苯酞治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(18.71±4.35)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(17.29±4.82)明顯減少(P0.01);⑸假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞預(yù)防治療組、丁苯酞治療組的學(xué)習(xí)成績(jī)之間無(wú)顯著性差異(P0.05)。 以上結(jié)果提示VD模型小鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)降低,丁苯酞可以改善其學(xué)習(xí)成績(jī)。 1.2記憶成績(jī) 術(shù)后第30天,分別進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn),測(cè)試跳臺(tái)試驗(yàn)潛伏時(shí)間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number/5min)作為記憶成績(jī),水迷宮試驗(yàn)游完全程時(shí)間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number / 3 min)作為記憶成績(jī)。 跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果顯示:⑴與假手術(shù)對(duì)照組的潛伏時(shí)間(148.92±20.83)s比較,VD模型組小鼠記憶階段的潛伏時(shí)間(78.67±19.17)s明顯縮短(P0.01);⑵與VD模型組的潛伏時(shí)間比較,丁苯酞治療組小鼠記憶階段的潛伏時(shí)間(131.41±18.82)s及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠記憶階段的的潛伏時(shí)間(128.57±18.29)s均明顯延長(zhǎng)(P0.01);⑶與假手術(shù)對(duì)照組的錯(cuò)誤次數(shù)(0.32±0.05)比較,VD模型組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(1.72±0.13)明顯增加(P0.01);⑷與VD模型組的錯(cuò)誤次數(shù)比較,丁苯酞治療組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(0.54±0.08)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠記憶階段的的錯(cuò)誤次數(shù)(0.50±0.07)均明顯減少(P0.01);⑸假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞預(yù)防治療組、丁苯酞治療組之間的記憶成績(jī)無(wú)顯著性差異(P0.05)。結(jié)果提示VD模型小鼠的記憶成績(jī)降低,丁苯酞可以改善其記憶成績(jī)。 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示:⑴與假手術(shù)對(duì)照組的游全程時(shí)間(67.82±8.79)比較,VD模型組小鼠記憶階段的游全程時(shí)間(137.40±11.86)明顯延長(zhǎng)(P0.01);⑵與VD模型組的游全程時(shí)間比較,丁苯酞治療組小鼠記憶階段的游全程時(shí)間(88.73±9.53)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠記憶階段的游全程時(shí)間(83.87±8.62)明顯縮短(P0.01);⑶與假手術(shù)對(duì)照組的錯(cuò)誤次數(shù)(9.57±2.91)比較,模型組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(20.90±4.25)明顯增多(P0.01);⑷與VD模型組的錯(cuò)誤次數(shù)比較,丁苯酞治療組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(11.17±3.04)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(10.27±2.83)明顯減少(P0.01);⑸假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞治療組、丁苯酞預(yù)防治療組的記憶成績(jī)之間無(wú)顯著性差異(P0.05)。 以上結(jié)果提示VD模型小鼠的記憶成績(jī)降低,丁苯酞可以改善其記憶成績(jī)。 1.3 VD小鼠海馬病理學(xué)改變 在光鏡下,⑴假手術(shù)對(duì)照組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞核大而圓,核仁明顯,細(xì)胞排列較致密整齊。⑵相比之下,VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞松散,層次不清,有細(xì)胞缺失現(xiàn)象;炎性細(xì)胞浸潤(rùn);部分細(xì)胞旁有空染區(qū),核固縮、胞質(zhì)濃染、胞體變小,并且有膠質(zhì)細(xì)胞增生形成結(jié)節(jié)。⑶丁苯酞治療組和預(yù)防治療組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列尚整齊,未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),核固縮現(xiàn)象較少見。 2 VD小鼠海馬CA1區(qū)AMPA-GluR2受體表達(dá)水平及丁苯酞的影響 2.1 AMPA-GluR2免疫組化染色 小鼠10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,石蠟包埋,冠狀切片,采用SP法行免疫組化染色,觀察GluR2陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的變化。結(jié)果顯示:⑴與假手術(shù)對(duì)照組海馬CA1區(qū)AMPA-GluR2陽(yáng)性神經(jīng)元面密度(124.37±7.48)比較,VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)GluR2陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值(27.69±5.15)明顯減少(P0.05);⑵與VD模型組比較,丁苯酞治療組小鼠海馬CA1區(qū)GluR2陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值(88.57±10.98)和丁苯酞預(yù)防組小鼠海馬CA1區(qū)GluR2陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值(94.42±12.37)明顯增多(P0.05);⑶丁苯酞治療組、丁苯酞預(yù)防治療組、假手術(shù)對(duì)照組海馬CA1區(qū)GluR2陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值之間無(wú)明顯差異(P0.05)。此可以提示VD小鼠海馬CA1區(qū)GluR2水平降低參與了VD的發(fā)病機(jī)制,丁苯酞和丁苯酞預(yù)防治療組可以防止VD小鼠海馬CA1區(qū)GluR2水平表達(dá)下降而促進(jìn)其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)的改善。 2.2 AMPA-GluR2 mRNA RT-PCR檢測(cè) 冰上迅速分離小鼠海馬,Trizol (Invitrogen公司)提取海馬總RNA,測(cè)定其濃度及純度。每個(gè)樣品取2μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再各取1μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取RT-PCR產(chǎn)物5μL在2 %瓊脂糖凝膠上電泳,用UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描定量電泳條帶的灰度,以GluR2 /β-actin表示產(chǎn)物的相對(duì)含量,凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。結(jié)果顯示:⑴與假手術(shù)對(duì)照組小鼠海馬CA1區(qū)GluR2 mRNA表達(dá)的灰度值(0.96±0.21)比較,VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)GluR2 mRNA表達(dá)的灰度值(0.28±0.07)顯著降低(P0.05);⑵與VD模型組比較,丁苯酞治療組小鼠海馬CA1區(qū)GluR2 mRNA表達(dá)的灰度值(0.71±0.15)和丁苯酞預(yù)防治療組小鼠海馬CA1區(qū)GluR2 mRNA表達(dá)的灰度值(0.75±0.18)顯著升高(P0.05);⑶丁苯酞組、丁苯酞預(yù)防治療組、假手術(shù)對(duì)照組海馬CA1區(qū)GluR2 mRNA表達(dá)的灰度值之間無(wú)明顯差異(P0.05)。此可以提示VD小鼠海馬CA1區(qū)GluR2水平降低參與了VD的發(fā)病機(jī)制,丁苯酞可以防止VD小鼠海馬CA1區(qū)GluR2 mRNA水平表達(dá)下降而促進(jìn)其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)的改善。 3 VD小鼠海馬CA1區(qū)NMDA-NR2B受體表達(dá)水平及丁苯酞的影響 免疫組化觀察NMDA-NR2B受體的變化,RT-PCR觀察NMDA-NR2B mRNA表達(dá)的變化。方法同2。 3.1 NMDA-NR2B受體免疫組化染色 結(jié)果顯示:⑴與假手術(shù)對(duì)照組海馬CA1區(qū)NMDA-NR2B陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值為:(149.27±8.67)比較,VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)NR2B陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值(29.70±2.09)明顯減少(P0.05);⑵與VD模型組比較,丁苯酞預(yù)防治療組小鼠海馬CA1區(qū)NMDA-NR2B陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值(108.51±7.28)和丁苯酞組小鼠海馬CA1區(qū)NMDA-NR2B陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值(100.53±10.00)明顯增多(P0.05);⑶丁苯酞組、丁苯酞預(yù)防治療組、假手術(shù)對(duì)照組海馬CA1區(qū)NMDA-NR2B陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值之間無(wú)明顯差異(P0.05)。此可以提示VD小鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體水平降低參與了VD的發(fā)病機(jī)制,丁苯酞可以防止VD小鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體水平表達(dá)下降而促進(jìn)其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)的改善。 3.2 NMDA受體mRNA RT-PCR檢測(cè) 結(jié)果顯示:⑴與假手術(shù)對(duì)照組小鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體mRNA表達(dá)的灰度值(0.71±0.18)比較,VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體mRNA表達(dá)的灰度值(0.22±0.04)顯著降低(P0.05);⑵與VD模型組比較,丁苯酞治療組小鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體mRNA表達(dá)的灰度值(0.54±0.11)和丁苯酞預(yù)防組小鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體mRNA表達(dá)的灰度值(0.59±0.20)顯著升高(P0.05);⑶丁苯酞組、丁苯酞預(yù)防治療組、假手術(shù)對(duì)照組海馬CA1區(qū)NMDA受體mRNA陽(yáng)性神經(jīng)元密度之間無(wú)明顯差異(P0.05)。此可以提示VD小鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體水平降低參與了VD的發(fā)病機(jī)制,丁苯酞可以防止VD小鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體mRNA水平表達(dá)下降而促進(jìn)其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)的改善。 4 VD小鼠海馬神經(jīng)元鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及丁苯酞的影響 4.1 VD小鼠海馬神經(jīng)元靜息態(tài)[Ca2+]i的變化及丁苯酞的影響 小鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后處死,采用機(jī)械法在低溫修塊臺(tái)上快速分離雙側(cè)海馬組織,并制備海馬細(xì)胞懸液,負(fù)載Fluo-3/AM,采用流式細(xì)胞分析技術(shù)觀察了VD海馬細(xì)胞靜息態(tài)[Ca2+]i變化特征及丁苯酞干預(yù)效果。結(jié)果顯示:⑴與假手術(shù)對(duì)照組小鼠海馬細(xì)胞靜息態(tài)[Ca2+]i濃度(1.29±0.32)比較,VD模型組小鼠海馬細(xì)胞靜息態(tài)[Ca2+]i濃度(1.92±0.35)顯著升高(P0.01);⑵與VD模型組比較,丁苯酞治療組小鼠海馬細(xì)胞靜息態(tài)[Ca2+]i濃度(1.34±0.28)和丁苯酞預(yù)防組小鼠海馬細(xì)胞靜息態(tài)[Ca2+]i濃度(1.33±0.41)顯著降低(P0.05);⑶丁苯酞治療組、丁苯酞預(yù)防治療組、假手術(shù)對(duì)照組小鼠海馬細(xì)胞靜息態(tài)[Ca2+]i濃度之間無(wú)明顯差異(P0.05)。此可以提示VD小鼠海馬細(xì)胞鈣超載參與了其發(fā)病機(jī)制,丁苯酞可以抑制VD小鼠海馬細(xì)胞鈣超載而改善其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)。 4.2 VD小鼠海馬神經(jīng)元CaMPKⅡ表達(dá)水平的變化特征及丁苯酞的影響 小鼠斷頭處死,快速分離海馬組織,提取總蛋白�？捡R斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白濃度定量。應(yīng)用Western-Blot方法對(duì)VD小鼠海馬組織CaMPKⅡ的蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示:⑴與假手術(shù)對(duì)照組小鼠海馬組織CaMPKⅡ蛋白表達(dá)水平(1.06±0.14)比較,VD模型組小鼠海馬組織CaMPKⅡ蛋白表達(dá)水平(0.30±0.07)顯著降低(P0.05);⑵與VD模型組比較,丁苯酞預(yù)防治療組小鼠海馬組織CaMPKⅡ蛋白表達(dá)水平(0.98±0.27)和丁苯酞治療組小鼠海馬組織CaMPKⅡ蛋白表達(dá)水平(0.94±0.13)顯著升高(P0.01);⑶假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞治療組、丁苯酞預(yù)防治療組小鼠海馬組織CaMPKⅡ蛋白表達(dá)水平之間無(wú)明顯差異(P0.05)。此可以提示VD小鼠海馬組織CaMPKⅡ蛋白表達(dá)水平的降低參與了VD的發(fā)病機(jī)制,丁苯酞可以防止并改善VD小鼠海馬神經(jīng)元CaMPKⅡ蛋白表達(dá)水平下降而促進(jìn)其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)改善。 4.3 VD小鼠海馬神經(jīng)元CaMPKⅡmRNA RT-PCR結(jié)果 標(biāo)本取材同2。結(jié)果顯示:⑴與假手術(shù)對(duì)照組小鼠海馬CA1區(qū)CaMPKⅡmRNA表達(dá)的灰度值(0.92±0.15)比較,VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)CaMPKⅡmRNA表達(dá)的灰度值(0.31±0.06)顯著降低(P0.05);⑵與VD模型組比較,丁苯酞治療組小鼠海馬CA1區(qū)CaMPKⅡmRNA表達(dá)的灰度值(0.78±0.11)和丁苯酞預(yù)防組小鼠海馬CA1區(qū)CaMPKⅡmRNA表達(dá)的灰度值(0.82±0.14)明顯增多(P0.05);⑶假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞組、丁苯酞預(yù)防治療組海馬CA1區(qū)CaMPKⅡmRNA表達(dá)的灰度值之間無(wú)明顯差異(P0.05)。此可以提示VD小鼠海馬CA1區(qū)CaMPKⅡ水平降低參與了VD的發(fā)病機(jī)制,丁苯酞可以防止VD小鼠海馬CA1區(qū)CaMPKⅡmRNA水平表達(dá)下降而促進(jìn)其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)的改善。 5 VD小鼠海馬神經(jīng)元CREB水平變化及丁苯酞的影響 5.1 VD小鼠海馬神經(jīng)元CREB表達(dá)水平的變化特征及丁苯酞的影響 小鼠斷頭處死,快速分離海馬組織,提取核蛋白�？捡R斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白濃度定量。應(yīng)用Western-Blot方法對(duì)VD小鼠海馬組織CREB的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示:⑴與假手術(shù)對(duì)照組小鼠海馬組織CREB蛋白表達(dá)水平(1.37±0.21)比較,VD模型組小鼠海馬組織CREB蛋白表達(dá)水平(0.43±0.06)顯著降低(P0.05);⑵與VD模型組比較,丁苯酞治療組小鼠海馬組織CREB蛋白表達(dá)水平(1.06±0.12)和丁苯酞預(yù)防治療組小鼠海馬組織CREB蛋白表達(dá)水平(1.12±0.14)顯著升高(P0.01);⑶丁苯酞治療組、丁苯酞預(yù)防治療組、假手術(shù)對(duì)照組小鼠海馬組織CREB蛋白表達(dá)水平之間無(wú)明顯差異(P0.05)。此可以提示VD小鼠海馬組織CREB蛋白表達(dá)水平的降低參與了VD的發(fā)病機(jī)制,丁苯酞可以防止并改善VD小鼠海馬組織CREB蛋白表達(dá)水平下降而促進(jìn)其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)改善。 5.2 VD小鼠海馬神經(jīng)元CREB mRNA RT-PCR結(jié)果 取材方法同2。結(jié)果顯示:⑴與假手術(shù)對(duì)照組小鼠海馬CA1區(qū)CREBmRNA表達(dá)的灰度值(0.98±0.17)比較,VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)CREB mRNA表達(dá)的灰度值(0.29±0.04)顯著降低(P0.05);⑵與VD模型組比較,丁苯酞治療組小鼠海馬CA1區(qū)CREB mRNA表達(dá)的灰度值(0.82±0.09)和丁苯酞預(yù)防治療組小鼠海馬CA1區(qū)CREB mRNA表達(dá)的灰度值(0.84±0.11)明顯增多(P0.05);⑶假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞組、丁苯酞預(yù)防治療組海馬CA1區(qū)CREB mRNA表達(dá)的灰度值之間無(wú)明顯差異(P0.05)。此可以提示VD小鼠海馬CA1區(qū)CREB水平降低參與了VD的發(fā)病機(jī)制,丁苯酞可以防止VD小鼠海馬CA1區(qū)CREB mRNA水平表達(dá)下降而促進(jìn)其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)的改善。 結(jié)論: ⑴本實(shí)驗(yàn)建立的VD小鼠模型可模擬人類VD以學(xué)習(xí)和記憶能力缺損為主的認(rèn)知功能障礙,是研究VD比較理想的動(dòng)物模型,對(duì)深入研究VD是可行的。VD模型小鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)病理性變化。 ⑵VD小鼠海AMPA-GluR2蛋白和mRNA表達(dá)水平降低,與其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)下降相一致,提示GluR2表達(dá)水平降低可能參與了VD的發(fā)病。 ⑶VD小鼠海馬NMDA-NR2B蛋白和mRNA表達(dá)水平降低,與其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)下降相一致,提示NMDA-NR2B表達(dá)水平降低可能參與了VD的發(fā)病。 ⑷VD小鼠海馬細(xì)胞靜息態(tài)[Ca2+]i升高,CaMPKⅡ蛋白表達(dá)及CaMPKⅡmRNA水平降低,導(dǎo)致鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)功能紊亂,可能參與了VD的分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制。 ⑸VD小鼠海馬神經(jīng)元CREB蛋白及mRNA表達(dá)水平降低,與其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)下降相一致,提示CREB蛋白表達(dá)水平降低可能參與了VD的分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制。 丁苯酞在改善VD小鼠學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)的同時(shí),可顯著減輕VD小鼠海馬細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i、CaMPKⅡ、NR2B、GluR2和CREB水平等方面的異常,從而發(fā)揮對(duì)VD的治療作用,并且改善了海馬組織CA1區(qū)病變,此與其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)改善相一致。提示此藥可能具有改善VD的藥理學(xué)作用。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R749.16

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 吳碩琳;丁苯酞治療新發(fā)急性腔隙性腦梗死合并輕度認(rèn)知功能障礙的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2813902