【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)作為一種中樞退行性疾病,是老年癡呆的最主要形式。依據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)結(jié)果,世界上大約有2700萬人口受到該病的影響。目前,淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(Amyloid Cascade Hypothesis)是一種主流的關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的推測(cè)。該假說認(rèn)為患者腦內(nèi)堆積過多的p淀粉樣多肽是造成AD的最根本原因。1999年,Schenk等首先開展了以Aβ為靶點(diǎn)的AD主動(dòng)免疫治療研究,將人纖維化的Aβ1-42(簡(jiǎn)稱Aβ42)多肽聯(lián)合弗氏佐劑免疫APP轉(zhuǎn)基因小鼠Tg2576后,小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)Aβ42的抗體,減少了大腦內(nèi)的淀粉樣斑塊,改善了認(rèn)知能力。隨后,動(dòng)物模型上的其他相關(guān)研究表明AD的主動(dòng)免疫治療策略是有效的,但之后的AN-1792臨床試驗(yàn)結(jié)果表明Aβ42中存在的2個(gè)T細(xì)胞表位(17-21,29-42)誘導(dǎo)產(chǎn)生的T細(xì)胞免疫反應(yīng)使得受試者出現(xiàn)了急性腦膜炎癥狀。目前關(guān)于AD主動(dòng)免疫的研究更傾向于使用Aβ42的B細(xì)胞表位(1-15)并去除有害的T細(xì)胞表位,既讓疫苗達(dá)到促進(jìn)抗體生成的目的,又從根本上避免之前臨床試驗(yàn)所產(chǎn)生的不良反應(yīng)。因此,我們?cè)诖死碚摶A(chǔ)上進(jìn)行了破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病B細(xì)胞表位重組亞單位疫苗和核酸疫苗的研究工作。 首先進(jìn)行了破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病B細(xì)胞表位重組亞單位疫苗的研究,設(shè)計(jì)了3種融合多個(gè)Aβ1-15(簡(jiǎn)稱Aβ15)串聯(lián)基因、PADRE基因和破傷風(fēng)毒素重鏈C端(簡(jiǎn)稱TTC)基因的重組蛋白原核表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)了重組融合蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)并成功地純化得到了電泳級(jí)純度的重組蛋白。然后將純化獲得的重組蛋白免疫普通Balb/C小鼠,測(cè)定的抗Aβ特異性抗體水平結(jié)果顯示重組蛋白免疫動(dòng)物后能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的Aβ特異性抗體,并且通過血清抗體的亞型分析和脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示免疫反應(yīng)完全偏向于Th2型。斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明產(chǎn)生的抗Aβ抗體傾向于與Aβ寡聚體結(jié)合,與纖維狀A(yù)β結(jié)合能力較弱。進(jìn)一步將其中一種重組蛋白免疫APP轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組蛋白在模型小鼠中仍然具有良好的免疫原性,免疫特性與普通Balb/C小鼠相似。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示免疫后小鼠認(rèn)知能力得到了一定改善。小鼠大腦組織免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明免疫組小鼠Aβ斑塊明顯減少。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示重組蛋白作為預(yù)防或治療AD的候選亞單位疫苗具有良好的應(yīng)用前景。 在重組蛋白亞單位疫苗研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病B細(xì)胞表位核酸疫苗的研究。設(shè)計(jì)了2種融合6個(gè)Aβ1-15串聯(lián)基因、PADRE基因和破傷風(fēng)毒素重鏈C端基因的DNA真核表達(dá)載體作為DNA疫苗。經(jīng)IFA檢測(cè)表明得到的2種真核表達(dá)載體均能使Aβ15和TTC基因在真核細(xì)胞中得到有效地表達(dá)。DNA疫苗免疫普通小鼠誘導(dǎo)生成了較高水平的抗Aβ抗體,并且免疫反應(yīng)完全偏向于Th2型。斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然提示設(shè)計(jì)的DNA疫苗產(chǎn)生的抗體傾向與Aβ可溶性寡聚體結(jié)合。DNA疫苗免疫APP轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠后,也產(chǎn)生了良好的免疫反應(yīng),并且免疫組小鼠大腦組織內(nèi)的Aβ斑塊明顯少于未免疫組小鼠,提示該DNA疫苗可能擁有較好的免疫預(yù)防效果,可作為AD疫苗的一種新發(fā)展方向。 綜上,本研究設(shè)計(jì)和制備了3種重組蛋白亞單位疫苗和2種重組核酸疫苗,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各疫苗在普通Balb/C小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的針對(duì)Aβ42的特異性抗體,并且有效地避免了Th1型免疫反應(yīng),免疫反應(yīng)完全偏向于Th2型。斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)表明產(chǎn)生的抗體傾向于與Aβ寡聚體結(jié)合,提示抗體可能針對(duì)毒性較大的Aβ寡聚體擁有更好的清除或中和能力,這一免疫特性對(duì)疫苗的下一步深入研究具有重要意義。疫苗免疫AD轉(zhuǎn)基因小鼠以后,產(chǎn)生了同普通Balb/C小鼠的相當(dāng)?shù)拿庖咝Ч?并且小鼠認(rèn)知能力得到了改善,腦組織內(nèi)的Aβ斑塊明顯少于未免疫組轉(zhuǎn)基因小鼠。本研究首次證實(shí)了破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)阿爾茨海默病B細(xì)胞表位疫苗能夠提高其免疫原性反應(yīng)的可行性。以上結(jié)果表明本研究設(shè)計(jì)和制備的這種新型重組Aβ15表位疫苗擁有良好的免疫效果,具備了新型AD疫苗的發(fā)展方向,具有良好的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R749.16
【圖文】：

毒PTIG一rx圖2一2重組蛋白原核表達(dá)載體pTIG一Trx一TTC一 SAp15一PAORE克隆示意圖首先擴(kuò)增下rC序列，并在其兩端加入EcoRI和子石門dlll酶切位點(diǎn)，然后再通過這2個(gè)酶切位點(diǎn)將竹C序列連入載體pTIG一Trx一6A印5一PADRE當(dāng)中，并且去除掉1個(gè)Ap序列，最終得到原核表達(dá)載體。

羅了一一 !6A6151PADRE1TTC/下下〔 .C1HispTI行·丁rx叫”二:圖2一1重組蛋白原核表達(dá)載體PTIG一下以一 6Ap15一PADRE一TTC/PTIG汀以一 6Ap15一PADRE一TTC一C克隆示意圖首先擴(kuò)增ITC/Tl，C一C序列，并在其兩端加入sacl和乃。I酶切位點(diǎn)，然后再通過這2個(gè)酶切位點(diǎn)將TrC/TrC一C序列連入載體pTIG一Trx一6A邵5一PADRE當(dāng)中，最終得到2種原核表達(dá)載體。PTIG一Trx魁F，們r(jià)C一A協(xié)R.TTC一AB護(hù)石‘ORI封矛刀dlll EcoRIfindlll而石洲竺些上竺些生獷飛竺夕f‘ORI Hind111毒PTIG一rx圖2一2重組蛋白原核表達(dá)載體pTIG一Trx一TTC一 SAp15一PAORE克隆示意圖首先擴(kuò)增下rC序列，并在其兩端加入EcoRI和子石門dlll酶切位點(diǎn)，然后再通過這2個(gè)酶切位點(diǎn)將竹C序列連入載體pTIG一Trx一6A印5一PADRE當(dāng)中

每組4一8只，雌雄各半，設(shè)Ap一TTC一CS林g組和Aps林g平行對(duì)照組共2組免疫組，另設(shè)PBS對(duì)照組。12周齡時(shí)開始進(jìn)行免疫，重組蛋白溶于 150ulPBS，加入1/4體積的Al(OH)3佐劑后，雙側(cè)四頭肌注射。免疫實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟如圖2一3，共進(jìn)行五次免疫，前二次免疫間隔2周，第三、四次免疫間隔3周，第五次免疫間隔8周。共進(jìn)行9次小鼠尾部采血(詳細(xì)采血時(shí)間見圖2一3注解)。免疫實(shí)驗(yàn)完成后24周(小鼠達(dá)到12月齡)進(jìn)行小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，39周(小鼠達(dá)到15.5月齡)從每組隨機(jī)挑選部分小鼠進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，其余小鼠繼續(xù)觀察其血清抗體水平至免疫后47周(小鼠達(dá)到17.5月齡)。}采血+免疫t， 123行為學(xué)實(shí)驗(yàn)免疫組化實(shí)驗(yàn) 6..， 5..寧d二..寧毒12

【共引文獻(xiàn)】

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1 楊e

本文編號(hào)：2801754