【摘要】：研究背景:焦慮癥是當(dāng)今精神疾病中最普遍的一種精神障礙疾病,給個人及社會帶來了極大的精神壓力和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。由于焦慮障礙病因多樣,發(fā)病機制復(fù)雜,病理過程關(guān)聯(lián)的分子機制研究有待深入闡明。臨床上對焦慮癥的主要治療方法包括心理治療、行為認(rèn)知治療及藥物治療,其中藥物治療貫穿始終,目前主要應(yīng)用于焦慮障礙的治療藥物包括:傳統(tǒng)的苯二氮卓類(Benzodiazepines,BDZs)、選擇性五羥色胺重攝取抑制劑(Selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs)、五羥色胺-去甲腎上腺素重攝取抑制劑(Serotonin-norepinephrine reuptake inhibitors,SNRIs)及單胺氧化酶抑制劑等。但是這些藥物由于具有依賴性、起效慢、順應(yīng)性差、停藥反應(yīng)等副作用而極大地限制了其在臨床的應(yīng)用。因此,更為深入研究焦慮癥的分子機制,將有助于尋找和開發(fā)新的藥物靶點,為焦慮障礙的臨床治療提供新思路。TMEMs(Transmembrane protein)是一類跨膜蛋白,近年來已報道多個TMEM蛋白在驚恐障礙、焦慮障礙等神經(jīng)精神疾病中發(fā)揮重要作用。TMEM74在2008年被首次報道,近期研究表明該蛋白是一種與癌癥信號通路相關(guān)的自噬誘導(dǎo)分子,但是尚且缺乏對TMEM74在體功能的研究�；赥MEM74在成年人的腦內(nèi)高度聚集,推測對神經(jīng)系統(tǒng)功能具有一定作用。研究目的:本研究擬通過研究TMEM74在臨床焦慮患者及焦慮動物模型樣本中的變化規(guī)律及調(diào)控作用;闡明Tmem74蛋白參與調(diào)控焦慮障礙的分子機制;最后通過基因操縱調(diào)控Tmem74蛋白表達(dá),探究是否能夠有效逆轉(zhuǎn)小鼠焦慮表型及修復(fù)損傷的神經(jīng)元功能,爭取為焦慮癥的診治提供新的藥物靶點。研究方法與結(jié)果:一、收集臨床焦慮病人血清樣本以及焦慮模型小鼠腦組織樣本,通過免疫印跡法及免疫熒光染色法考察候選TMEMs蛋白在焦慮病理過程的變化規(guī)律。實驗結(jié)果表明,候選蛋白分子中TMEM74在焦慮患者及焦慮小鼠樣本中表達(dá)顯著降低。此外,通過基因操縱在焦慮小鼠BLA區(qū)過表達(dá)Tmem74蛋白,發(fā)現(xiàn)能夠有效逆轉(zhuǎn)小鼠的焦慮表型,提示Tmem74對焦慮行為具有調(diào)控作用。二、構(gòu)建Tmem74基因敲除小鼠(Tmem74-/-),通過行為學(xué)檢測、電生理膜片鉗記錄等方法考察Tmem74基因缺失誘發(fā)的行為表型及神經(jīng)元功能的變化情況。利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù),考察BLA錐體神經(jīng)元特異性敲除Tmem74是否能夠誘發(fā)焦慮表型。實驗結(jié)果表明,Tmem74缺失或條件性敲除Tmem74均能夠增加錐體神經(jīng)元的興奮性介導(dǎo)小鼠焦慮行為產(chǎn)生,提示Tmem74在焦慮的病理過程中扮演重要作用。三、以BLA錐體神經(jīng)元為研究對象,利用電生理膜片鉗記錄及免疫印跡法檢測,發(fā)現(xiàn)Tmem 74--小鼠Ih功能受損,HCN1膜蛋白表達(dá)量降低。通過藥物調(diào)控HCN活性驗證Tmem74缺失導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增加經(jīng)由HCN通道蛋白介導(dǎo)。此外,通過分子生物學(xué)方法構(gòu)建Tmem74不同跨膜段敲除的截斷體質(zhì)粒,考察Tmem74的細(xì)胞膜定位情況;利用免疫共沉淀技術(shù)考察Tmem74與HCN1之間的相互作用關(guān)系,并驗證不同跨膜結(jié)構(gòu)域在Tmem74生物學(xué)功能上的作用。實驗結(jié)果顯示,Tmem74細(xì)胞膜定位能力及與HCN1共定位關(guān)系由TM1跨膜結(jié)構(gòu)介導(dǎo),同時Tmem74通過與HCN1直接作用調(diào)控其膜蛋白表達(dá)及離子通道功能。四、通過基因操縱過表達(dá)Tmem74蛋白,考察Tmem74-/-小鼠行為表型及神經(jīng)元活動的異常是否可逆。實驗結(jié)果顯示,BLA區(qū)錐體神經(jīng)元特異性過表達(dá)Tmem74能夠有效逆轉(zhuǎn)Tmem 74缺失導(dǎo)致的神經(jīng)元興奮性增加、HCN通道功能損傷及其介導(dǎo)的焦慮表型。結(jié)論:首次發(fā)現(xiàn)TMEM74在臨床焦慮病人及焦慮小鼠體內(nèi)蛋白表達(dá)量降低,且過表達(dá)Tmem74能夠治療小鼠的焦慮表型。證明Tmem74參與焦慮障礙的調(diào)控,但對運動協(xié)調(diào)性、肌肉功能、認(rèn)知功能等方面無顯著影響。其對焦慮行為的調(diào)控是通過增加BLA區(qū)錐體神經(jīng)元興奮性實現(xiàn)的。進一步分子機制研究發(fā)現(xiàn),Tmem74直接調(diào)控HCN通道增強神經(jīng)元興奮性介導(dǎo)焦慮行為,TM1跨膜結(jié)構(gòu)域在其中發(fā)揮重要作用。此外,Tmem74對焦慮的調(diào)控是持續(xù)的、可逆的,基因操縱重新表達(dá)Tmem74能夠有效修復(fù)損傷的神經(jīng)元功能,逆轉(zhuǎn)Tmem74基因敲除小鼠焦慮表型。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R749.72
【圖文】：

者的血清樣本（表１．１），對候選的ＴＭＥＭｓ蛋白使用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法進行檢測。逡逑檢測結(jié)果顯示：ＴＭＥＭ７４蛋白在焦慮患者樣本中表達(dá)水平顯著降低，而其他的逡逑ＴＭＥＭｓ蛋白表達(dá)量未見顯著變化（圖１．２）。逡逑以上實驗結(jié)果顯示，ＴＭＥＭ７４在人腦內(nèi)集中分布，并且在焦慮患者體內(nèi)表達(dá)逡逑降低，提示ＴＭＥＭ７４在焦慮障礙中可能存在重要作用。那么ＴＭＥＭ７４在焦慮癥逡逑中的具體作用如何？是否可以調(diào)控焦慮行為表型？具體的作用機制及上下游調(diào)控逡逑蛋白是什么？本課題后續(xù)研究將針對這些問題進行深入闡明。逡逑ＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ＴＰＭ）逡逑Ｔｉｓｓｕｅ邋ｂｍｅｍ７４邋Ｔｍｅｍ１６８邋Ｔｍｅｍ３９ａ邋Ｔｍｅｍ１０６ｂ邋Ｔｍｅｍ１０７邋＊邋Ｔｍｅｍ１３２ｅ邋Ｔｍｅｍ２３７逡逑＼邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑Ｂｒａｉｎ邐｜邋■邐■邐■■■１邐■■邐｜邐■■■邋｜邋｜ＨＩ逡逑＾１邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑ｔｉｓｓｕｅｓ邐Ｉ邐丨邐丨邐＿Ｈ逡逑Ｉ邐Ｉ邐曬邐■逡逑Ｂｏｎｅ邋ｍａｒｒｏｗ邋＆邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑ｉ

者的血清樣本（表１．１），對候選的ＴＭＥＭｓ蛋白使用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法進行檢測。逡逑檢測結(jié)果顯示：ＴＭＥＭ７４蛋白在焦慮患者樣本中表達(dá)水平顯著降低，而其他的逡逑ＴＭＥＭｓ蛋白表達(dá)量未見顯著變化（圖１．２）。逡逑以上實驗結(jié)果顯示，ＴＭＥＭ７４在人腦內(nèi)集中分布，并且在焦慮患者體內(nèi)表達(dá)逡逑降低，提示ＴＭＥＭ７４在焦慮障礙中可能存在重要作用。那么ＴＭＥＭ７４在焦慮癥逡逑中的具體作用如何？是否可以調(diào)控焦慮行為表型？具體的作用機制及上下游調(diào)控逡逑蛋白是什么？本課題后續(xù)研究將針對這些問題進行深入闡明。逡逑ＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ＴＰＭ）逡逑Ｔｉｓｓｕｅ邋ｂｍｅｍ７４邋Ｔｍｅｍ１６８邋Ｔｍｅｍ３９ａ邋Ｔｍｅｍ１０６ｂ邋Ｔｍｅｍ１０７邋＊邋Ｔｍｅｍ１３２ｅ邋Ｔｍｅｍ２３７逡逑＼邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑Ｂｒａｉｎ邐｜邋■邐■邐■■■１邐■■邐｜邐■■■邋｜邋｜ＨＩ逡逑＾１邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑ｔｉｓｓｕｅｓ邐Ｉ邐丨邐丨邐＿Ｈ逡逑Ｉ邐Ｉ邐曬邐■逡逑Ｂｏｎｅ邋ｍａｒｒｏｗ邋＆邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑ｉ

們對同年齡的雄性ＷＴ小鼠進行慢性束縛應(yīng)激造模。連續(xù)造模１４天后用行為學(xué)逡逑方法檢測焦慮水平，結(jié)果顯示與雄性同齡對照組小鼠相比，雄性ＣＩＳ小鼠存在顯逡逑著的焦慮樣表型（圖１．３ａ－ｃ）。行為學(xué)實驗后，采集小鼠的ＢＬＡ腦區(qū)樣本，使用逡逑免疫突光及Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法檢測Ｔｍｅｍ７４蛋白表達(dá)情況。免疫焚光結(jié)果顯示，逡逑在ＣＩＳ小鼠ＢＬＡ腦區(qū)Ｔｍｅｍ７４表達(dá)顯著降低（圖１．３邋ｄ，ｅ），Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ結(jié)果顯逡逑示Ｔｍｅｍ７４的膜蛋白表達(dá)量降低４０％左右（圖１．３邋ｆ）。由于在臨床上，焦慮癥在逡逑男性和女性中均發(fā)病，為了考察Ｔｍｅｍ７４在焦慮小鼠中變化是否存在性別差異，逡逑我們對同齡的雌性ＷＴ小鼠進行慢性束縛應(yīng)激造模。高架十字迷宮及曠場實驗結(jié)逡逑果顯示，與同性別對照組小鼠相比雌性ＣＩＳ小鼠存在焦慮樣表型（圖１．４邋ａ－ｄ）。逡逑同時，雌性ＣＩＳ小鼠ＢＬＡ腦區(qū)Ｔｍｅｍ７４的膜蛋白表達(dá)水平也顯著下降（圖１．４邋ｅ）。逡逑以上結(jié)果提示，Ｔｍｅｍ７４蛋白水平在焦慮模型小鼠腦內(nèi)顯著降低，并且無性別差逡逑異。那么

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