【摘要】：(一)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和癡呆病腦脊液中蛋白組學(xué)變化研究 [目的]檢測sCJD病例和對(duì)照組各組腦脊液中瓜氨酸化蛋白及其相關(guān)作用酶的表達(dá),進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)瓜氨酸化和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的致病機(jī)制,旨在發(fā)現(xiàn)一種可能的腦脊液早期標(biāo)志物來對(duì)病例進(jìn)行干預(yù),通過對(duì)活體病例的檢測可以監(jiān)控sCJD病例的發(fā)病過程,對(duì)sCJD病的早期診斷和干預(yù)具有重要的臨床意義。另外,本課題還測定了不同神經(jīng)系統(tǒng)癡呆疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥患者腦脊液中PrPc、Aβ42和Tau蛋白的表達(dá),分析其表達(dá)量的異同點(diǎn),以期了解不同神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病發(fā)病機(jī)制的異同及其和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的關(guān)系,對(duì)發(fā)展新的治療方法、設(shè)計(jì)安全有效地治療具有重要意義。 [方法]本課題采用病例-對(duì)照研究,選取已經(jīng)確診的sCJD患者的腦脊液和對(duì)照組各30例,利用蛋白免疫(Western blot)和二維電泳及質(zhì)譜鑒定方法及瓜氨酸化抗體來檢測各組腦脊液中瓜氨酸化蛋白的表達(dá)量,并用免疫熒光雙標(biāo)法檢測各組腦組織切片中的瓜氨酸化蛋白定位。另外還選取確診的AD、sCJD、腦炎和腦膜炎患者腦脊液標(biāo)本分別17、12、14、15例,采用Western blot法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),研究和分析腦脊液中PrPc、Aβ42和Tau蛋白的表達(dá),采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 [結(jié)果] 1.在sCJD組腦脊液中瓜氨酸化蛋白較對(duì)照組有明顯增加。說明瓜氨酸化蛋白量的異常增加有可能與CJD疾病的致病性相關(guān)。 2.相對(duì)于對(duì)照組,sCJD病例腦脊液中PAD2酶的表達(dá)水平和活性顯著提高。sCJD病例組較對(duì)照組中存在著過表達(dá)的瓜氨酸化GFAP蛋白。 3.通過免疫熒光雙標(biāo)法顯示在sCJD病例大腦額葉皮質(zhì)中GFAP蛋白和瓜氨酸化蛋白的共定位,PAD2酶和GFAP蛋白在sCJD病例大腦額葉皮質(zhì)中共定位。 4.免疫分析結(jié)果為sCJD組PrPc的表達(dá)量大約為對(duì)照組的70%左右,AD組PrPc的表達(dá)量也較對(duì)照組低,但高于sCJD組,而腦炎和腦膜炎組PrPc的表達(dá)量較在上述各組中最低。酶聯(lián)免疫吸附法結(jié)果為PrPc檢測值分別為138±75ng/ml、160±76ng/ml,正常對(duì)照組為225±68ng/ml。 5.免疫分析結(jié)果為sCJD、AD和腦炎及腦膜炎病例腦脊液中Aβ42蛋白的表達(dá)量都較對(duì)照組下降,其中,sCJD組下降最顯著,約為對(duì)照組的40%。酶聯(lián)免疫吸附法Aβ42檢測值分別為554±169pg/ml339±127pg/ml,正常對(duì)照組為976±125pg/ml。 6.免疫分析結(jié)果為sCJD和AD組Tau蛋白含量明顯的高于對(duì)照組,腦膜炎和腦炎組次之,也不同程度的稍高于對(duì)照組。酶聯(lián)免疫吸附法為sCJD組腦脊液中Tau蛋白(6803±2678pg/ml)與正常對(duì)照組(107±24pg/ml)相比,其值超過63倍；而AD組(409±107pg/ml)也比正常值(107±24pg/ml)高出3倍多,腦炎和腦膜炎組(167±44 ng/ml)則比正常對(duì)照組(107±24pg/ml)高出50%多。 [結(jié)論] 1. sCJD組腦脊液中瓜氨酸化蛋白較對(duì)照組有明顯增加,通過2D-電泳和質(zhì)譜分析確定過表達(dá)的瓜氨酸化蛋白為GFAP蛋白,免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)瓜氨酸化GFAP蛋白與瓜氨酸蛋白點(diǎn)共定位。GFAP蛋白的瓜氨酸化可能成為神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中一種潛在的早期標(biāo)志物。 2.sCJD病例腦脊液中PAD2酶的表達(dá)水平及活性較對(duì)照組顯著增,其在GFAP蛋白的瓜氨酸化過程發(fā)揮著重要作用。 3.鈣離子濃度是PAD2酶催化瓜氨酸化過程中的重要調(diào)節(jié)因素。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道我們認(rèn)為在sCJD病變時(shí),鈣離子升高,高濃度的鈣離子激活了PAD2酶,進(jìn)而導(dǎo)致GFAP蛋白質(zhì)瓜氨酸化。 4 sCJD組、AD組、腦炎組(腦炎和腦膜炎)PrPc蛋白的表達(dá)量較正常對(duì)照組低,提示PrPc蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥病理機(jī)制之間起到了橋梁作用。 5 sCJD組、AD組、腦炎組(腦炎和腦膜炎)Aβ42蛋白的表達(dá)量均較正常對(duì)照組低,反應(yīng)出Aβ42蛋白可能也與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和神經(jīng)變性疾病有一定關(guān)聯(lián)。 6. sCJD組、AD組、腦炎組(腦炎和腦膜炎)Tau蛋白的表達(dá)量均較正常對(duì)照組高,其中sCJD組升高最為顯著。 (二)Fe203納米顆粒體外生物毒性效應(yīng)研究 [背景]隨著納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展,納米技術(shù)逐漸延伸到人們的日常生活當(dāng)中,越來越多的納米材料進(jìn)入環(huán)境。由于納米材料特殊的物理化學(xué)特性,使其在很多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。近期研究發(fā)現(xiàn)納米技術(shù)在生物、醫(yī)藥上也具有巨大的應(yīng)用潛力,包括疾病診斷、分子成像、生物傳感器熒光標(biāo)識(shí)物、藥物和基因傳輸、蛋白質(zhì)的檢測、DNA結(jié)構(gòu)探索、組織工程學(xué)等。因此人類暴露于納米顆粒的途徑多種多樣：吸入、攝取以及皮膚途徑等。一旦進(jìn)入人體,各種各樣的納米顆粒就會(huì)分布到人體的各種器官,甚至可以通過生物屏障。納米顆粒對(duì)環(huán)境和包括人在內(nèi)的生物體的毒性及相容性逐漸引起了人們的高度關(guān)注。加強(qiáng)納米顆粒對(duì)生物、環(huán)境的毒性效應(yīng)的研究,可以使人們?cè)诔浞窒硎芗{米技術(shù)帶來的優(yōu)越的同時(shí),盡量避免納米顆粒的毒性效應(yīng)對(duì)人體的傷害。 [目的、方法]鐵的氧化物在人們的口常生活中應(yīng)用非常廣泛,一方面其納米形態(tài)可以用在染料、催化、陶瓷、能源轉(zhuǎn)換等不同的領(lǐng)域,與人類的生活和環(huán)境的安全密切相關(guān)；另一方面作為一種重要的磁性材料在智能靶向治療和藥物載體等醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。其作為藥物載體和靶向特性的前提是與生物體具有生物相容性,不能產(chǎn)生明顯的毒副作用。論文本章內(nèi)容就是通過MTT比色法、乳酸脫氫酶釋放法、細(xì)胞的脂化過氧化作用檢測等方法研究氧化鐵納米顆粒對(duì)人體細(xì)胞的生物毒性效應(yīng)和毒理機(jī)制,以期達(dá)到為納米顆粒的實(shí)際應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)的目的。 [結(jié)果]通過各種實(shí)驗(yàn)測試手段我們得到以下結(jié)果。氧化鐵納米顆粒對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)具有劑量和時(shí)間特性,大劑量納米顆粒和長時(shí)間暴露于納米顆粒環(huán)境中都可引起嚴(yán)重的生物毒性。不同劑量的氧化鐵納米顆粒作用于Hek-293細(xì)胞都可以引起SOD和GSH-Px活性的降低,LDH釋放量增加,MDA含量升高。 [結(jié)論]通過分析我們得到以下主要結(jié)論：(1)納米氧化鐵對(duì)HEK293細(xì)胞表現(xiàn)出劑量和時(shí)間特性的生物毒性效應(yīng)。(2)納米氧化鐵對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性機(jī)制主要是活性氧自由基的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的納米顆粒生物毒性。氧化鐵納米顆粒與Hek-293細(xì)胞產(chǎn)生作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子(O2-)、羥白由基(·OH)、過氧化氫(H202)等活性氧水平的增加,攻破抗氧化酶、解毒酶等組成抗氧化防御系統(tǒng),引起細(xì)胞膜的破壞和細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R741;R749.16

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本文編號(hào)：2795855