發(fā)布時間：2020-08-13 16:15

【摘要】：抑郁癥是目前全球范圍內(nèi)最常見的情感障礙類精神疾病,是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致殘疾的最大原因。在過去的十年間,全球范圍內(nèi)抑郁癥的患病人數(shù)逐年增加,且每年因抑郁癥自殺的患者就有80萬人,給當(dāng)今社會的發(fā)展帶來巨大的負(fù)擔(dān)。迄今為止,關(guān)于抑郁癥發(fā)病機(jī)制的學(xué)說眾說紛紜,臨床上用于治療抑郁癥的藥物也都以單胺類神經(jīng)遞質(zhì)為主要靶點(diǎn),如選擇性5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)再攝取抑制劑和5-HT受體轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑等。盡管此類藥物已在臨床廣泛應(yīng)用60余載,但其中多數(shù)藥物存在起效慢、治療范圍窄,療效差等問題,對眾多的重度抑郁癥患者治療無效。因此,尋求抑郁治療的高效新靶點(diǎn)已迫在眉睫。研究報道,抑郁癥患者前額葉-邊緣系統(tǒng)顯現(xiàn)出葡萄糖低代謝的特征,且抑郁癥患者也比正常人更易患有代謝綜合征;而代謝綜合征患者罹患抑郁癥的風(fēng)險則比正常人高。因此,有科學(xué)家提出“抑郁癥是Ⅱ型代謝綜合征”。研究顯示,抑郁癥和代謝綜合征之間有多種共同的病理特征和發(fā)病機(jī)制,如慢性炎癥反應(yīng)等。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)中,激活小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞或者其他髓細(xì)胞能誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生,從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子、趨化因子以及其他炎癥介質(zhì)的合成與釋放,最終加重神經(jīng)損傷。一般認(rèn)為,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分為M1和M2兩種極化形態(tài),不同極化狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)的生理功能具有明顯差異。因此,研究抑郁癥病理變化下的小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2型轉(zhuǎn)化有助于進(jìn)一步探討抑郁癥發(fā)病的分子機(jī)制,以及探尋抑郁癥治療的新策略。過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)屬于核激素受體家族的配體激活轉(zhuǎn)錄因子,參與糖脂質(zhì)代謝、細(xì)胞分化以及炎癥反應(yīng)等。愈來愈多的研究表明,PPARs在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用。例如,PPARα/γ雙重拮抗劑能抑制小鼠腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)從而減輕缺血復(fù)灌誘導(dǎo)的腦損傷;PPARβ/δ激動劑能抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化、減輕病理損傷以及降低死亡率等。這些研究提示,PPARs可能在抑郁癥病理過程中同樣扮演著重要的調(diào)控作用。文獻(xiàn)報道,PPARγ激動藥羅格列酮可改善慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(Chronic mild unpredictable stress,CMS)誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為,但其具體的作用機(jī)制尚不明確。PPARβ/δ是腦內(nèi)表達(dá)最豐富的PPARs家族受體,而有關(guān)其在腦內(nèi)作用的研究卻少有報道。因此,本論文工作擬研究PPARs介導(dǎo)的抗抑郁效應(yīng)及其作用機(jī)制亟需進(jìn)一步深入研究和探討,從而為基于“非單胺類”抗抑郁新藥的研發(fā)提供新的思路�；趯嶒炇业那捌诠ぷ骰A(chǔ),本文第一部分主要研究PPARβ/δ在抑郁癥病理進(jìn)程中對星形膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制。建立CMS所致C57BL/6小鼠抑郁癥動物模型,通過行為學(xué)、免疫組織化學(xué)以及透射電子顯微鏡等方法進(jìn)行觀察和檢測,從整體水平評價激活PPARβ/δ改善CMS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為的作用,以及對腦內(nèi)海馬神經(jīng)元以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用;應(yīng)用皮質(zhì)酮刺激原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞建立體外應(yīng)激模型,進(jìn)一步研究激活PPARβ/δ介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用及分子機(jī)制。本文第二部分主要研究PPARγ在抑郁癥病理進(jìn)程中對小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用及機(jī)制。該部分工作應(yīng)用脂多糖(Lipopolysaccharid,LPS)刺激原代的小膠質(zhì)細(xì)胞建立體外神經(jīng)炎癥模型,觀察PPARγ對小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響。研究結(jié)果顯示,拮抗PPARγ可誘導(dǎo)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化,該作用依賴于LKB1-AMPK信號通路的激活。第一部分激活PPARβ/δ對慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激所致抑郁癥小鼠的治療作用及機(jī)制目的:研究并闡明激活PPARβ/δ對CMS所致抑郁癥小鼠的治療作用及機(jī)制,為探尋抑郁癥治療的新策略和開發(fā)新型高效抗抑郁藥物提供實驗依據(jù),以拓寬PPARβ/δ的藥理學(xué)作用。方法:1.應(yīng)用野生型C57BL/6小鼠建立CMS抑郁癥動物模型;2.應(yīng)用糖水偏愛試驗、強(qiáng)迫游泳試驗、曠場試驗和懸尾試驗進(jìn)行行為學(xué)檢測;3.應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察海馬腦區(qū)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)以及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;4.應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化;5.培養(yǎng)原代的星形膠質(zhì)細(xì)胞,采用免疫熒光染色結(jié)合體視學(xué)計數(shù)法,鑒定原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度;6.應(yīng)用皮質(zhì)酮(Corticosterone,Cort)刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞,建立體外應(yīng)激模型;7.應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試驗,觀察激活PPARβ/δ對皮質(zhì)酮所致星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響,并確定治療的有效濃度;8.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM),觀察激活PPARβ/δ對皮質(zhì)酮所致星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響;9.應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western blotting,WB)法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá),觀察激活PPARβ/δ對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡的影響;10.應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù),觀察激活PPARβ/δ對GRP78和p-IRE1α蛋白結(jié)合能力的影響。結(jié)果:1.PPARs三種亞型在抑郁癥模型小鼠海馬腦區(qū)的表達(dá)下調(diào);2.激活PPARβ/δ可顯著改善抑郁癥模型小鼠的抑郁樣行為;3.抑郁癥模型小鼠海馬腦區(qū)尼氏小體形態(tài)和數(shù)量未發(fā)生變化;4.激活PPARβ/δ可抑制抑郁癥模型小鼠海馬腦區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和損傷;5.激活PPARβ/δ可抑制皮質(zhì)酮所致原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和損傷;6.激活PPARβ/δ可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GRP78與p-IRE1α的結(jié)合,并抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的IRE1α通過介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡途徑。結(jié)論:1.激活PPARβ/δ可改善CMS模型小鼠的抑郁樣癥狀,對海馬腦區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用;2.激活PPARβ/δ通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的IRE1α通路介導(dǎo)的凋亡途徑,從而發(fā)揮對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。第二部分拮抗PPARγ通過促進(jìn)LKB1-AMPK信號通路依賴性自噬而誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1-M2型轉(zhuǎn)化目的:研究并闡明拮抗PPARγ調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的新作用及機(jī)制,為神經(jīng)炎癥相關(guān)的疾病提供潛在有效的治療策略,同時為臨床的抗抑郁治療提供新的理論依據(jù)。方法:1.培養(yǎng)原代的小膠質(zhì)細(xì)胞,應(yīng)用免疫熒光染色結(jié)合體視學(xué)計數(shù)法,鑒定原代小膠質(zhì)細(xì)胞的純度;2.應(yīng)用LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞,建立體外神經(jīng)炎癥模型;3.應(yīng)用普通顯微鏡觀察拮抗PPARγ對LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞阿米巴樣狀態(tài)的影響,并確定藥物有效濃度;4.應(yīng)用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)觀察激活PPARγ和拮抗PPARγ分別對LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞M1型和M2型標(biāo)記物表達(dá)的影響;5.應(yīng)用免疫熒光共定位法觀察拮抗PPARγ對LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞M1型和M2型標(biāo)記物表達(dá)的影響;6.應(yīng)用FCM法觀察拮抗PPARγ對LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞M1型和M2型標(biāo)記物表達(dá)的影響;7.應(yīng)用WB法檢測自噬相關(guān)蛋白以及自噬上游相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá),觀察拮抗PPARγ對LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)自噬水平的影響;8.應(yīng)用電子顯微鏡觀察拮抗PPARγ對LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)自噬水平的影響;9.應(yīng)用mcherry-EGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代小膠質(zhì)細(xì)胞,激光共聚焦觀察拮抗PPARγ對LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)自噬水平的影響;10.應(yīng)用吞噬實驗觀察拮抗PPARγ對LPS刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能的影響;11.應(yīng)用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-ip)的方法,觀察拮抗PPARγ對LKB1轉(zhuǎn)錄激活的靶向調(diào)控作用;12.應(yīng)用si RNA轉(zhuǎn)染原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV2細(xì)胞,驗證拮抗PPARγ發(fā)揮的相關(guān)調(diào)控通路是否被取消。結(jié)果:1.羅格列酮激活PPARγ不能抑制LPS所致的原代小膠質(zhì)細(xì)胞M1激活,且不影響小膠質(zhì)細(xì)胞M1-M2型轉(zhuǎn)化;2.PPARγ拮抗劑T0070907能促進(jìn)M1型原代小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化;3.拮抗PPARγ可逆轉(zhuǎn)LPS抑制小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的作用;4.拮抗PPARγ可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的作用依賴于LKB1-AMPK信號通路的激活;5.拮抗PPARγ通過激活LKB1促進(jìn)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化;6.敲除小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)PPARγ也可激活LKB1-AMPK信號通路,抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化。結(jié)論:1.拮抗PPARγ促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化;2.拮抗PPARγ通過增強(qiáng)自噬促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1-M2表型的轉(zhuǎn)變;3.拮抗PPARγ促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的作用依賴于LKB1-AMPK信號通路的激活。本文工作的主要創(chuàng)新之處:1.確認(rèn)激活PPARβ/δ的抗抑郁效應(yīng);闡明激活PPARβ/δ通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的IRE1α凋亡途徑,進(jìn)而發(fā)揮對星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。為基于“非單胺類”抗抑郁新藥的研發(fā)提供新的思路和實驗依據(jù)。2.發(fā)現(xiàn)拮抗PPARγ能促進(jìn)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化的新作用;闡明其促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1-M2極化的作用機(jī)制是增強(qiáng)LKB1-AMPK信號通路依賴性小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬,為抗抑郁癥的抗炎治療和臨床應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R749.4

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本文編號：2792229