【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer‘s disease,AD),是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。大腦胞外淀粉樣沉積(老年斑,senile plaque SP)是AD的一種重要病理標志物,主要成分為高度聚集的β-淀粉樣蛋白(amyloidβ,Aβ),一種由39-43個氨基酸組成的多肽。Aβ在腦部代謝紊亂被認為與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但是具體分子機制尚不清楚。Aβ的N端含有多個組氨酸,這些組氨酸能與血紅素(heme),銅離子等發(fā)生配位作用,使得Aβ與血紅素和銅離子有較強親和力,且形成的金屬復(fù)合物具有較強過氧化物酶活性。蛋白質(zhì)酪氨酸硝化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,硝化修飾會導(dǎo)致酪氨酸苯環(huán)空間位阻增加,p K_a下降,蛋白質(zhì)負電荷增加并最終影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。有意思的是,Aβ的氨基酸序列中含有唯一一個酪氨酸殘基(Y10),十分接近其金屬離子結(jié)合位點,應(yīng)該極易發(fā)生硝化修飾。因此,在過氧化氫和亞硝酸鹽存在的條件下,Aβ有可能發(fā)生硝化修飾,然而對于硝化Aβ結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)研究依然處于空白。探究酪氨酸硝化修飾對Aβ的結(jié)構(gòu)和功能的影響可以更加深入了解Aβ在AD發(fā)生發(fā)展過程中所扮演的角色,為AD的預(yù)防和治療提供新的思路和治療靶標。本文通過定制硝化修飾的系列Aβ及截短的Aβ,采用多種現(xiàn)代分析測試技術(shù),系統(tǒng)研究了酪氨酸殘基硝化修飾對Aβ結(jié)構(gòu)和功能的影響,獲得了以下研究成果:(1)酪氨酸硝化修飾降低Aβ_(1-40)聚集和減少細胞毒性:通過采用人工合成的Aβ_(1-40)和Aβ_(1-40)NT(10號位酪氨酸突變?yōu)?-硝基酪氨酸)作為研究對象,避免化學(xué)修飾方法得到硝化Aβ_(1-40)所造成的氨基酸氧化、雙酪氨酸化的問題。結(jié)果顯示heme-NO_2~--H_2O_2體系能夠硝化Aβ_(1-40),硝化Aβ_(1-40)仍然能與血紅素結(jié)合,兩者復(fù)合物依然具有很強的過氧化物酶活性,可以繼續(xù)催化硝化其它未硝化的Aβ_(1-40)。進一步檢測發(fā)現(xiàn)酪氨酸硝化修飾能夠顯著降低Aβ_(1-40)聚集并抑制纖維的生成。Aβ_(1-40)酪氨酸硝化修飾后能夠顯著降低Aβ_(1-40)的細胞毒性。這些研究結(jié)果表明細胞有可能通過硝化修飾Aβ_(1-40),降低其聚集和細胞毒性從而防止Aβ_(1-40)大量分泌所導(dǎo)致的聚集和細胞毒性。(2)酪氨酸硝化修飾抑制Aβ_(1-42)聚集和細胞毒性的機理研究:選取Aβ_(1-42)和Aβ_(1-42)NT作為研究對象,證明了heme-NO_2~--H_2O_2體系能夠硝化Aβ_(1-42),Aβ_(1-42)NT-heme復(fù)合物具有很強的過氧化物酶活性能夠繼續(xù)催化硝化Aβ_(1-42)。熒光光譜,原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)和透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)的結(jié)果都表明酪氨酸硝化修飾顯著降低Aβ_(1-42)聚集并抑制纖維的生成。圓二色光譜結(jié)果表明酪氨酸硝化修飾并不影響Aβ_(1-42)自身折疊,表明酪氨酸硝化修飾有可能是通過抑制Aβ_(1-42)分子之間的相互作用達到抑制聚集目的。此外,采用氯化Aβ_(1-42)作為對照,發(fā)現(xiàn)Aβ_(1-42)Cl的聚集程度也顯著低于Aβ_(1-42)。這些結(jié)果提示酪氨酸硝化修飾可能是通過增加酪氨酸苯環(huán)上的空間位阻達到抑制聚集的目的。最后,細胞實驗結(jié)果顯示Aβ_(1-42)NT的細胞毒性顯著低于Aβ_(1-42),表明酪氨酸硝化修飾能夠顯著抑制Aβ_(1-42)聚集并降低其細胞毒性,該機制可能對Aβ_(1-42)行使正常生理功能至關(guān)重要。(3)酪氨酸硝化修飾抑制Cu~(2+)誘導(dǎo)的Aβ_(1-42)聚集和細胞毒性:選取Aβ_(1-42)、Aβ_(1-42)NT、Aβ_(1-16)和Aβ_(1-16)NT作為研究對象,結(jié)果表明Cu~(2+)-NO_2~--H_2O_2體系能夠硝化Aβ_(1-42)。酪氨酸硝化修飾對于Aβ和Cu~(2+)的結(jié)合以及兩者復(fù)合物的過氧化氫酶活性沒有影響。有意思的是,Cu~(2+)能夠顯著改變Aβ_(1-42)的二級結(jié)構(gòu)并加速Aβ_(1-42)聚集成為毒性寡聚體,而這一作用在Aβ_(1-42)NT上沒有任何體現(xiàn)。細胞實驗結(jié)果也顯示無論是否存在Cu~(2+),Aβ_(1-42)NT對細胞的毒性都顯著低于Aβ_(1-42)。此外,Aβ_(1-42)NT能夠通過螯合Cu~(2+)減弱它對細胞的損害。這些結(jié)果提示,Aβ_(1-42)可能具有保護細胞免受Cu~(2+)毒性損害的能力,而酪氨酸硝化修飾有可能是Aβ_(1-42)正確行使該功能的一種重要的保護機制。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R749.16;O641.4
【圖文】：

圖 1.1 a 老年斑；b 神經(jīng)原纖維纏結(jié)[13]Fig 1.1 a senile plaques; b neurofibrillary tangles.阿爾茨海默病茨海默病是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。該疾病最先于 1906 年 11 月由德AloisAlzheimer 發(fā)現(xiàn)并報道了該病的主要臨床特征以及組織病理改變，隨姓氏為這種病命名[14]。AD 與年齡高度相關(guān)，且隨著年齡的增長，其發(fā)。隨著科學(xué)技術(shù)和醫(yī)療水平的不斷進步，人類平均壽命不斷延長，相應(yīng)問題也日益嚴峻，隨之而來是 AD 患病人數(shù)與日俱增。據(jù)統(tǒng)計 2010 年60 萬 AD 患者，預(yù)計到 2040 年，這一數(shù)字將翻一番。我國是人口大國，的人口老齡化問題。據(jù)推算，中國 2040 年 AD 患者人數(shù)將達到 2200 萬

淀粉級聯(lián)假說[13]

圖 1.3 APP 蛋白水解過程[40]Fig 1.3 A schematic view of APP proteolytic cleavage.圖 1.4 Aβ1-40和 Aβ1-42的氨基酸序列Fig 1.4 The amino acid sequence of Aβ1-40and Aβ1-42.Aβ1-40和 Aβ1-42不但聚集能力不同，兩者的聚集方式，蛋白纖維結(jié)構(gòu)也存在著大差異。如圖 1.5 所示，Aβ1-40在聚集的初期會以單體，二聚體，三聚體，四聚體形式存在，并迅速達到動態(tài)平衡，而 Aβ1-42在聚集初期則能快速形成穩(wěn)定的五聚體者六聚體，隨后這些聚集體能夠進一步聚集成為更大的寡聚體、原纖維、成熟纖維[41Bernstein 等發(fā)現(xiàn) Aβ1-40在初期聚集達到平衡之后緩慢地通過不斷添加單體或者二聚體的方式形成更大的聚集體直至形成成熟纖維；而 Aβ完成初期聚集之后迅速形成 1

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