發(fā)布時間：2020-08-12 11:02

【摘要】： 第一部分：膽堿酯酶抑制劑治療血管性癡呆的實(shí)驗(yàn)研究 目的觀察膽堿酯酶抑制劑對慢性腦低灌注大鼠認(rèn)知功能障礙的治療作用并探討其膽堿能機(jī)制。 方法雙側(cè)頸總動脈同時結(jié)扎后的大鼠采用鹽酸多奈哌齊連續(xù)治療6周，再將其水迷宮試驗(yàn)、事件相關(guān)誘發(fā)電位(ERP)、膽堿酯酶及膽堿酯酶陽性神經(jīng)纖維的測定結(jié)果與正常組、低灌注組(雙側(cè)頸總動脈同時結(jié)扎六周)及鹽水治療組相比較。 結(jié)果低灌注組與正常組相比，水迷宮完成時間顯著延長，錯誤次數(shù)顯著增多(P＜0.05)，P300潛伏期顯著延長(P＜0.05)，膽堿酯酶濃度及膽堿纖維密度也顯著下降(P＜0.05)。鹽酸多奈哌齊治療組其膽堿酯酶濃度及膽堿纖維密度較低灌注組及鹽水治療組進(jìn)一步下降(P＜0.05)，但水迷宮試驗(yàn)結(jié)果卻較低灌注組及鹽水治療組顯著好轉(zhuǎn)(P＜0.05)，P300潛伏期的測定值也均顯著優(yōu)于低灌注組及鹽水治療組(P＜0.05)。 結(jié)論：慢性低灌注能顯著影響大鼠的認(rèn)知功能，認(rèn)知功能下降與膽堿酯酶濃度及膽堿纖維密度顯著下降相關(guān)。P300潛伏期測定是公認(rèn)的能反映認(rèn)知功能變化并能作為抗癡呆藥物臨床療效評價的一種客觀手段，其測定結(jié)果也從電生理角度證實(shí)了慢性低灌注大鼠認(rèn)知功能的損害。行為學(xué)及P300潛伏期測定結(jié)果均證實(shí)鹽酸多奈哌齊對慢性低灌注所造成的認(rèn)知功能損害有肯定的防治作用，這一作用可能與其抑制膽堿酯酶后腦組織中乙酰膽堿濃度升高有關(guān)。是否與其直接增加腦血流或激活膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶有關(guān)還有待深入研究。 第二部分：老化血管性癡呆大鼠模型的制作 目的：改良血管性癡呆大鼠模型，制作老化血管性癡呆大鼠模型，使其更接近人類血管性癡呆的病理生理特點(diǎn)，更有效地用于研究。 方法：采用D-半乳糖(D-gal)注射4周造成大鼠老化，并在此基礎(chǔ)上行雙側(cè)間隔72小時結(jié)扎頸總動脈，觀察雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎24小時后大鼠血腦屏障的開放情況。六周后成模，觀察成模大鼠腦內(nèi)有無梗死灶形成，同時檢測大鼠水迷宮試驗(yàn)、事件相關(guān)誘發(fā)電位潛伏期，海馬區(qū)錐體細(xì)胞和突觸素密度。 結(jié)果：改良大鼠模型的死亡率較小(17％)，水迷宮試驗(yàn)顯示模型組大鼠較正常組大鼠認(rèn)知功能有顯著的損害(P＜0.05)，P300測定結(jié)果也從電生理角度證實(shí)了模型組大鼠認(rèn)知功能的損害(P＜0.05)。海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂，數(shù)目明顯減少(P＜0.05)，突觸素密度也明顯下降(P＜0.05)。TTC染色結(jié)果證實(shí)該模型大鼠腦內(nèi)未見明顯梗死灶，伊文斯藍(lán)染色結(jié)果說明模型大鼠血腦屏障在雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后24小時無明顯開放情況。 結(jié)論：D-gal加雙側(cè)間隔頸總動脈結(jié)扎法制作老化血管性癡呆大鼠模型是成功的，且明顯降低了雙側(cè)頸總動脈同時結(jié)扎所致血管性癡呆模型的死亡率，復(fù)制了更接近人類血管性癡呆病理生理特點(diǎn)的大鼠癡呆模型，為今后研究血管性癡呆發(fā)病機(jī)理及藥物治療提供了良好的平臺。同時發(fā)現(xiàn)該模型大鼠在雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后24小時血腦屏障無明顯開放情況。 第三部分：同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療老化血管性癡呆大鼠的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)移植治療老化血管性癡呆模型大鼠后其認(rèn)知功能的改變及腦內(nèi)組織形態(tài)學(xué)變化。為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療血管性癡呆提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：分離培養(yǎng)鑒定BMSC后，以PBS將細(xì)胞調(diào)為1.0×10~6個細(xì)胞／μl的懸液備用。采用立體定位注射法在老化血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)雙側(cè)側(cè)腦室下區(qū)(SVZ區(qū))移植5.0×10~6個細(xì)胞，各組大鼠每日接受5-溴脫氧尿核苷(BrdU)腹腔注射持續(xù)六周。六周后比較各組大鼠水迷宮試驗(yàn)及P300潛伏期的差異；BrdU免疫組織化學(xué)染色法觀察各組大鼠SVZ區(qū)細(xì)胞增殖情況；HE染色法觀察CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)學(xué)變化；突觸素免疫組織化學(xué)染色法觀察CA3區(qū)突觸素密度改變。 結(jié)果：治療組ERP試驗(yàn)及水迷宮試驗(yàn)均顯示大鼠認(rèn)知功能有明顯改善(P＜0.05)，從行為學(xué)及電生理角度證實(shí)了BMSC移植治療對血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用；治療組大鼠SVZ區(qū)細(xì)胞增殖較對照組明顯增多(P＜0.05)；CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列較對照組整齊，數(shù)目較后者明顯增多(P＜0.05)；CA3區(qū)突觸素密度也較對照組顯著增多(P＜0.05)。 結(jié)論：BMSC移植治療腦梗塞模型的有效性已為許多研究者所公認(rèn)，但對于老化血管性癡呆模型大鼠的作用卻鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)BMSC移植入老化血管性癡呆大鼠SVZ區(qū)后，能明顯改善大鼠認(rèn)知功能，原因可能與腦組織功能重塑有關(guān)。這種重塑涉及錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及數(shù)目的改變，同時也和腦內(nèi)突觸重塑密不可分，但重塑的始動因素尚有待進(jìn)一步研究。 第四部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療老化血管性癡呆大鼠的機(jī)制研究 目的：研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)移植后老化血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能改善的可能機(jī)制。 方法：分離培養(yǎng)鑒定BMSC后，用Hochest33258將細(xì)胞標(biāo)上藍(lán)色熒光，PBS將藍(lán)色熒光細(xì)胞調(diào)為1.0×10~6個細(xì)胞／μl的懸液備用。采用立體定位注射法在老化血管性癡呆模型大鼠腦內(nèi)雙側(cè)SVZ區(qū)移植5.0×10~6個熒光細(xì)胞，六周后采用免疫熒光染色法觀察BMSC在大鼠腦內(nèi)的分布及分化情況，同時采用RT-PCR檢測移植區(qū)NGF-mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：帶藍(lán)色熒光的BMSC移植入腦六周后可見BMSC在腦組織中圍繞側(cè)腦室周邊分布，明顯勾勒出側(cè)腦室形狀，同時可見細(xì)胞向外較大幅度擴(kuò)散。在SVZ區(qū)和皮質(zhì)區(qū)均可見分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的BMSC。相比于對照組，NGF-mRNA的表達(dá)在BMSC治療組有明顯的升高(P＜0.05)。 結(jié)論：BMSC與宿主腦組織相互聯(lián)系，通過分泌NGF，促進(jìn)自身及神經(jīng)干細(xì)胞分化等機(jī)制促使老化血管性癡呆大鼠腦組織的功能重塑從而最終改善了認(rèn)知功能。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R749.1
【圖文】：

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞倒置顯微鏡下觀X100

骨髓間充質(zhì)細(xì)胞腦內(nèi)分布圖xlo

Hoechst熒光標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞X100

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2790449