【摘要】：阿爾茨海默氏癥(Alzheimer's disease, AD)又稱老年癡呆癥,是以德國精神病學家Alois Alzheimer名字命名的一種老年神經(jīng)變性綜合癥。該病以記憶逐步減退和進行性認知障礙為臨床特征。年齡是AD的重要危險因素。由于人均壽命延長,老年人口迅速增長,AD患病人數(shù)必然相應增加。我國65歲以上老人中AD患病率為0.3‰左右,已與發(fā)達國家接近。AD自1906年發(fā)現(xiàn)至今已有百多年歷史,迄今仍未有有效治療方法。該病不僅造成老年人群生活質量下降,同時也給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟和心理負擔,成為老齡社會中主要衛(wèi)生保健和社會問題。所以尋找有切實有效的治療藥物一直是AD研究領域的重要課題。 據(jù)目前細胞學和分子生物學的研究普遍認為,以β-淀粉樣蛋白(p-amyloid protein, Aβ)為主要成分的神經(jīng)元纏結(neurofibrillary tangles, NFTs)和老年斑(senile plaques, SP)形成是引起腦內膽堿能神經(jīng)元的功能障礙和死亡的主要原因。Aβ與小膠質細胞表面的清道夫受體或糖基化終產物受體結合,激活小膠質細胞,導致炎性因子的釋放。這些炎性因子如：IL-1、TNF-αIL-6等造成神經(jīng)元的功能和行為障礙。最近的證據(jù)表明,炎性介質會通過上調β-分泌酶刺激淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein, APP)的加工過程并形成一個惡性循環(huán),使病情不斷進展。有多篇文獻闡明,非甾體類抗炎藥可以降低患AD的危險性并延緩發(fā)病,由此可以推斷：慢性炎癥過程是AD病理過程中的重要機制,抗炎是治療AD的切實可行的措施。 粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF),是由174個氨基酸組成的多肽和4%葡萄糖苷型糖鏈組成的糖蛋白。主要在中性粒細胞及神經(jīng)細胞和膠質細胞表達。它的主要作用有：1促增殖與分化,2抗炎,3抗凋亡。最近的研究證實,G-CSF具有神經(jīng)保護的作用,作用機理主要是通過減少致炎因子的釋放,而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。TNF和IL-1p是炎癥中的主要調節(jié)因子,G-CSF主要通過對兩者的抑制作用發(fā)揮它的抗炎作用,其機制不明。 煙堿型膽堿能受體(Nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs)是配體門控性離子通道,由五個亞單位構成。α7nAChR是脊椎動物腦中分布最廣的兩類nAchR亞型之一,在神經(jīng)突觸傳遞過程中其重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),a7nAChR表達增高能夠降低致炎因子的分泌,是膽堿能抗炎通路的關鍵受體。a7nAChR的表達增高能夠改善AD患者的認知能力。 根據(jù)已往的研究發(fā)現(xiàn),G-CSF可能通過抑制炎癥治療AD。作為最新的治療AD的策略,本研究將G-CSF應用于APPV717I轉基因AD模型小鼠,以探討G-CSF的抗炎作用和可能的抗炎機制,為今后對AD的治療提供理論依據(jù)和事實依據(jù)。本研究共分四部分進行。 第一部分G-CSF對阿爾茨海默病小鼠的認知功能的影響 目的對G-CSF治療前后老年癡呆癥模型小鼠和野生小鼠進行生物行為學研究,通過水迷宮測試對老年癡呆癥模型小鼠和野生小鼠的學習記憶功能進行觀察,探討G-CSF對老年癡呆癥模型小鼠和野生小鼠的認知功能的影響。 方法 1.10月齡APP V717轉基因老年癡呆模型小鼠和10月齡野生小鼠,分為對照組、G-CSF治療組和野生組。對照組連續(xù)7天皮下注射PBS (phosphate belancedsolution；磷酸鹽緩沖液)；G-CSF治療組連續(xù)7天皮下注射G-CSF;野生組連續(xù)7天皮下注射PBS。按照G-CSF治療完成后的天數(shù),三組小鼠又分為三個亞組：7天組、14天組、28天組。 2.各組小鼠于注射前后分別進行水迷宮定位航行試驗。 3.取個時間點小鼠腦組織制作病理切片,用HE (haematoxylineosin)和Nissl染色進行形態(tài)學觀察。 4.利用統(tǒng)計軟件對G-CSF治療前后的老年癡呆模型小鼠和野生型老齡小鼠的水迷宮實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。觀察G-CSF對老年癡呆模型小鼠的認知的影響。 結果 1.各組小鼠Morris水迷宮測試結果：AD模型組逃避潛伏期和游泳距離較野生組明顯延長(P0.01),G-CSF治療組顯著縮短潛伏期和游泳距離,和野生組水平相當。同組大鼠,隨著訓練時段的增加,G-CSF治療組的潛伏期和游泳距離越來越短(P0.01)。各組小鼠游泳速度沒有明顯差異�？梢耘懦騻�體差異引起的不同。 2.HE及Nissl染色示野生小鼠海馬神經(jīng)元結構清晰完整,細胞核結構正常,染色質分布均勻,胞漿內尼氏小體豐富。AD模型組可觀察到小鼠海馬神經(jīng)元損傷,表現(xiàn)為神經(jīng)元腫脹、破裂,排列紊亂,胞漿內尼氏小體減少,存活神經(jīng)元數(shù)目較對照組減少(P0.05)。G-CSF治療組海馬神經(jīng)元結構與野生組相似。 結論 1.阿爾茨海默病小鼠認知功能減退。 2. G-CSF治療后阿爾茨海默病小鼠認知功能改善。 3. G-CSF治療對阿爾茨海默病小鼠海馬神經(jīng)元有保護作用。 第二部分G-CSF對阿爾茨海默病小鼠腦內炎癥的影響 目的研究G-CSF對APPV717I轉基因阿爾茨海默病小鼠腦內炎癥的影響。 方法 1.10月齡APP V717轉基因老年癡呆模型小鼠和10月齡野生小鼠,分為對照組、G-CSF治療組和野生組。對照組連續(xù)7天皮下注射PBS (phosphate belanced solution;磷酸鹽緩沖液)；G-CSF治療組連續(xù)7天皮下注射G-CSF;野生組連續(xù)7天皮下注射PBS。按照G-CSF治療完成后的天數(shù),三組小鼠又分為三個亞組：7天組、14天組、28天組。 2.小鼠分別在各時間點灌注多聚甲醛后取腦,免疫熒光的方法檢測小鼠大腦皮層細胞的IL-1β. TNF-a表達變化及G-CSF對其表達的影響。 結果 1.圖像分析結果顯示,AD模型7天組、AD模型14天組、AD模型28天組的IL-1β光密度值均高于同一天的G-CSF治療組和野生組,且有統(tǒng)計學意義(P0.01或0.05)；三組比較有顯著性差異(P0.05)。 2.圖像分析結果顯示,AD模型14天組、AD模型28天組的TNF-a光密度值均高于同一天的G-CSF治療組和野生組,且有統(tǒng)計學意義(P0.01或0.05)；三組比較有顯著性差異(P0.05)。 結論 1.阿爾茨海默病模型小鼠腦內炎癥因子IL-1β和TNF-a含量相對于野生型同齡小鼠有明顯升高。 2. G-CSF治療,可以降低阿爾茨海默病模型小鼠腦內炎癥因子IL-1β和TNF-a含量。 3.推測阿爾茨海默病模型小鼠腦內可能伴隨炎癥反應,這一反應參與了老年癡呆模型小鼠腦內神經(jīng)元的損傷過程。而G-CSF彳很可能通過抑制阿爾茨海默病模型小鼠的腦內炎性因子IL-1β、TNF-a的表達而抑制腦內的神經(jīng)炎癥反應,對阿爾茨海默病模型小鼠的大腦皮層神經(jīng)元起一定的保護作用。 第三部分G-CSF對阿爾茨海默病小鼠腦內的乙酰膽堿受體α7表達的影響 目的研究G-CSF對阿爾茨海默病小鼠腦內的a7nAChR的表達水平的影響,探討a7nAChR在膽堿能通路中的關鍵地位。 方法 1.10月齡APP V717轉基因老年癡呆模型小鼠和10月齡野生小鼠,分為對照組、G-CSF治療組和野生組。對照組連續(xù)7天皮下注射PBS (phosphate belancedsolution;磷酸鹽緩沖液)；G-CSF治療組連續(xù)7天皮下注射G-CSF;野生組連續(xù)7天皮下注射PBS。按照G-CSF治療完成后的天數(shù),三組小鼠又分為三個亞組：7天組、14天組、28天組。 2.各組小鼠分別在各時間點灌注多聚甲醛后取腦,制作冰凍切片。用免疫組化染色的方法檢測小鼠大腦皮層細胞α7nAChR的蛋白表達水平變化及G-CSF對其表達的影響。 2.將各組小鼠分別在各時間點斷頭取腦,腦組織-80℃存儲待用。 3.應用Western blotting方法檢測各亞組小鼠大腦α7nAChR的蛋白表達水平。 結果 (1)圖像分析結果顯示,G-CSF治療7天組、G-CSF治療14天組、G-CSF治療28天組的α7nAChR光密度值均高于同一天的AD模型組和野生組,且有統(tǒng)計學意義(P0.01或0.05)；三組比較有顯著性差異(P0.05)。 (2)α7nAChR蛋白表達比較：G-CSF治療7天組、G-CSF治療14天組、G-CSF治療28天組的α7nAChR蛋白表達均高于同一天的AD模型組和野生組,且有統(tǒng)計學意義(P0.01),同一天AD模型組α7nAChR蛋白的表達較野生組明顯降低(P0.01)；三組比較有顯著性差異(P0.05)。 結論 1.α7nAChR在各亞組小鼠大腦皮層細胞普遍表達。 2.阿爾茨海默病小鼠大腦皮層細胞α7nAChR的蛋白表達水平明顯降低。 3.應用G-CSF能夠明顯增加各亞組小鼠大腦皮層細胞α7nAChR的蛋白表達水平,對阿爾茨海默病小鼠具有神經(jīng)保護功能。 第四部分G-CSF對NF-kB的表達的影響及炎癥機制的研究 目的研究G-CSF對阿爾茨海默病小鼠腦內的NF-kB的表達水平的影響以及NF-kB表達水平與α7nAChR表達的關系,探討α7nAChR在膽堿能通路中的關鍵地位。 方法 1.10月齡APP V717轉基因老年癡呆模型小鼠和10月齡野生小鼠,分為對照組、G-CSF治療組和野生組。對照組連續(xù)7天皮下注射PBS (phosphate belanced solution;磷酸鹽緩沖液)；G-CSF治療組連續(xù)7天皮下注射G-CSF;野生組連續(xù)7天皮下注射PBS。按照G-CSF治療完成后的天數(shù),三組小鼠又分為三個亞組：7天組、14天組、28天組。 2.小鼠分別在各時間點灌注多聚甲醛后取腦,免疫熒光的方法檢測小鼠大腦皮層細胞的NF-kB表達變化及G-CSF對其表達的影響。 3.用統(tǒng)計學的方法對小鼠大腦皮層細胞的NF-kB表達變化和a7nAChR表達變化進行相關性分析。 結果 相關性分析顯示G-CSF治療后AD模型小鼠7天組、14天組、28天組腦內NF-kB和α7nAChR表達成負相關(7天組：r=-0.73,p=0.007；14天組：r=-0.83,p=0.008；28天組：r=-0.89,p=0.02,)。 結論 G-CSF治療后AD模型小鼠腦內NF-kB的表達水平與α7nAChR的表達水平成負相關,說明G-CSF治療的抗炎機制是通過增加a7nAChR的表達,降低了NF-kB表達,從而減少致炎因子的轉錄。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 常洋,秦川,尹紅星,朱華,蔡有余;建立阿爾茨海默癥的轉基因動物模型[J];解剖學報;2000年02期

2 肖雁;單可人;官志忠;;阿爾茨海默病發(fā)病機制中β淀粉樣蛋白對星形膠質細胞和神經(jīng)細胞α7尼古丁受體的影響[J];中華病理學雜志;2006年08期

本文編號：2787536