【摘要】：阿爾茨海默氏癥(Alzheimer's disease, AD)又稱老年癡呆癥,是以德國(guó)精神病學(xué)家Alois Alzheimer名字命名的一種老年神經(jīng)變性綜合癥。該病以記憶逐步減退和進(jìn)行性認(rèn)知障礙為臨床特征。年齡是AD的重要危險(xiǎn)因素。由于人均壽命延長(zhǎng),老年人口迅速增長(zhǎng),AD患病人數(shù)必然相應(yīng)增加。我國(guó)65歲以上老人中AD患病率為0.3‰左右,已與發(fā)達(dá)國(guó)家接近。AD自1906年發(fā)現(xiàn)至今已有百多年歷史,迄今仍未有有效治療方法。該病不僅造成老年人群生活質(zhì)量下降,同時(shí)也給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān),成為老齡社會(huì)中主要衛(wèi)生保健和社會(huì)問(wèn)題。所以尋找有切實(shí)有效的治療藥物一直是AD研究領(lǐng)域的重要課題。 據(jù)目前細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的研究普遍認(rèn)為,以β-淀粉樣蛋白(p-amyloid protein, Aβ)為主要成分的神經(jīng)元纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)和老年斑(senile plaques, SP)形成是引起腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元的功能障礙和死亡的主要原因。Aβ與小膠質(zhì)細(xì)胞表面的清道夫受體或糖基化終產(chǎn)物受體結(jié)合,激活小膠質(zhì)細(xì)胞,導(dǎo)致炎性因子的釋放。這些炎性因子如：IL-1、TNF-αIL-6等造成神經(jīng)元的功能和行為障礙。最近的證據(jù)表明,炎性介質(zhì)會(huì)通過(guò)上調(diào)β-分泌酶刺激淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein, APP)的加工過(guò)程并形成一個(gè)惡性循環(huán),使病情不斷進(jìn)展。有多篇文獻(xiàn)闡明,非甾體類抗炎藥可以降低患AD的危險(xiǎn)性并延緩發(fā)病,由此可以推斷：慢性炎癥過(guò)程是AD病理過(guò)程中的重要機(jī)制,抗炎是治療AD的切實(shí)可行的措施。 粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF),是由174個(gè)氨基酸組成的多肽和4%葡萄糖苷型糖鏈組成的糖蛋白。主要在中性粒細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。它的主要作用有：1促增殖與分化,2抗炎,3抗凋亡。最近的研究證實(shí),G-CSF具有神經(jīng)保護(hù)的作用,作用機(jī)理主要是通過(guò)減少致炎因子的釋放,而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。TNF和IL-1p是炎癥中的主要調(diào)節(jié)因子,G-CSF主要通過(guò)對(duì)兩者的抑制作用發(fā)揮它的抗炎作用,其機(jī)制不明。 煙堿型膽堿能受體(Nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs)是配體門控性離子通道,由五個(gè)亞單位構(gòu)成。α7nAChR是脊椎動(dòng)物腦中分布最廣的兩類nAchR亞型之一,在神經(jīng)突觸傳遞過(guò)程中其重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),a7nAChR表達(dá)增高能夠降低致炎因子的分泌,是膽堿能抗炎通路的關(guān)鍵受體。a7nAChR的表達(dá)增高能夠改善AD患者的認(rèn)知能力。 根據(jù)已往的研究發(fā)現(xiàn),G-CSF可能通過(guò)抑制炎癥治療AD。作為最新的治療AD的策略,本研究將G-CSF應(yīng)用于APPV717I轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠,以探討G-CSF的抗炎作用和可能的抗炎機(jī)制,為今后對(duì)AD的治療提供理論依據(jù)和事實(shí)依據(jù)。本研究共分四部分進(jìn)行。 第一部分G-CSF對(duì)阿爾茨海默病小鼠的認(rèn)知功能的影響 目的對(duì)G-CSF治療前后老年癡呆癥模型小鼠和野生小鼠進(jìn)行生物行為學(xué)研究,通過(guò)水迷宮測(cè)試對(duì)老年癡呆癥模型小鼠和野生小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行觀察,探討G-CSF對(duì)老年癡呆癥模型小鼠和野生小鼠的認(rèn)知功能的影響。 方法 1.10月齡APP V717轉(zhuǎn)基因老年癡呆模型小鼠和10月齡野生小鼠,分為對(duì)照組、G-CSF治療組和野生組。對(duì)照組連續(xù)7天皮下注射PBS (phosphate belancedsolution；磷酸鹽緩沖液)；G-CSF治療組連續(xù)7天皮下注射G-CSF;野生組連續(xù)7天皮下注射PBS。按照G-CSF治療完成后的天數(shù),三組小鼠又分為三個(gè)亞組：7天組、14天組、28天組。 2.各組小鼠于注射前后分別進(jìn)行水迷宮定位航行試驗(yàn)。 3.取個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠腦組織制作病理切片,用HE (haematoxylineosin)和Nissl染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。 4.利用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)G-CSF治療前后的老年癡呆模型小鼠和野生型老齡小鼠的水迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。觀察G-CSF對(duì)老年癡呆模型小鼠的認(rèn)知的影響。 結(jié)果 1.各組小鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果：AD模型組逃避潛伏期和游泳距離較野生組明顯延長(zhǎng)(P0.01),G-CSF治療組顯著縮短潛伏期和游泳距離,和野生組水平相當(dāng)。同組大鼠,隨著訓(xùn)練時(shí)段的增加,G-CSF治療組的潛伏期和游泳距離越來(lái)越短(P0.01)。各組小鼠游泳速度沒(méi)有明顯差異。可以排除因個(gè)體差異引起的不同。 2.HE及Nissl染色示野生小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰完整,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常,染色質(zhì)分布均勻,胞漿內(nèi)尼氏小體豐富。AD模型組可觀察到小鼠海馬神經(jīng)元損傷,表現(xiàn)為神經(jīng)元腫脹、破裂,排列紊亂,胞漿內(nèi)尼氏小體減少,存活神經(jīng)元數(shù)目較對(duì)照組減少(P0.05)。G-CSF治療組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與野生組相似。 結(jié)論 1.阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能減退。 2. G-CSF治療后阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能改善。 3. G-CSF治療對(duì)阿爾茨海默病小鼠海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用。 第二部分G-CSF對(duì)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)炎癥的影響 目的研究G-CSF對(duì)APPV717I轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)炎癥的影響。 方法 1.10月齡APP V717轉(zhuǎn)基因老年癡呆模型小鼠和10月齡野生小鼠,分為對(duì)照組、G-CSF治療組和野生組。對(duì)照組連續(xù)7天皮下注射PBS (phosphate belanced solution;磷酸鹽緩沖液)；G-CSF治療組連續(xù)7天皮下注射G-CSF;野生組連續(xù)7天皮下注射PBS。按照G-CSF治療完成后的天數(shù),三組小鼠又分為三個(gè)亞組：7天組、14天組、28天組。 2.小鼠分別在各時(shí)間點(diǎn)灌注多聚甲醛后取腦,免疫熒光的方法檢測(cè)小鼠大腦皮層細(xì)胞的IL-1β. TNF-a表達(dá)變化及G-CSF對(duì)其表達(dá)的影響。 結(jié)果 1.圖像分析結(jié)果顯示,AD模型7天組、AD模型14天組、AD模型28天組的IL-1β光密度值均高于同一天的G-CSF治療組和野生組,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01或0.05)；三組比較有顯著性差異(P0.05)。 2.圖像分析結(jié)果顯示,AD模型14天組、AD模型28天組的TNF-a光密度值均高于同一天的G-CSF治療組和野生組,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01或0.05)；三組比較有顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論 1.阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)炎癥因子IL-1β和TNF-a含量相對(duì)于野生型同齡小鼠有明顯升高。 2. G-CSF治療,可以降低阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)炎癥因子IL-1β和TNF-a含量。 3.推測(cè)阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)可能伴隨炎癥反應(yīng),這一反應(yīng)參與了老年癡呆模型小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元的損傷過(guò)程。而G-CSF彳很可能通過(guò)抑制阿爾茨海默病模型小鼠的腦內(nèi)炎性因子IL-1β、TNF-a的表達(dá)而抑制腦內(nèi)的神經(jīng)炎癥反應(yīng),對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠的大腦皮層神經(jīng)元起一定的保護(hù)作用。 第三部分G-CSF對(duì)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)的乙酰膽堿受體α7表達(dá)的影響 目的研究G-CSF對(duì)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)的a7nAChR的表達(dá)水平的影響,探討a7nAChR在膽堿能通路中的關(guān)鍵地位。 方法 1.10月齡APP V717轉(zhuǎn)基因老年癡呆模型小鼠和10月齡野生小鼠,分為對(duì)照組、G-CSF治療組和野生組。對(duì)照組連續(xù)7天皮下注射PBS (phosphate belancedsolution;磷酸鹽緩沖液)；G-CSF治療組連續(xù)7天皮下注射G-CSF;野生組連續(xù)7天皮下注射PBS。按照G-CSF治療完成后的天數(shù),三組小鼠又分為三個(gè)亞組：7天組、14天組、28天組。 2.各組小鼠分別在各時(shí)間點(diǎn)灌注多聚甲醛后取腦,制作冰凍切片。用免疫組化染色的方法檢測(cè)小鼠大腦皮層細(xì)胞α7nAChR的蛋白表達(dá)水平變化及G-CSF對(duì)其表達(dá)的影響。 2.將各組小鼠分別在各時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦,腦組織-80℃存儲(chǔ)待用。 3.應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)各亞組小鼠大腦α7nAChR的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 (1)圖像分析結(jié)果顯示,G-CSF治療7天組、G-CSF治療14天組、G-CSF治療28天組的α7nAChR光密度值均高于同一天的AD模型組和野生組,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01或0.05)；三組比較有顯著性差異(P0.05)。 (2)α7nAChR蛋白表達(dá)比較：G-CSF治療7天組、G-CSF治療14天組、G-CSF治療28天組的α7nAChR蛋白表達(dá)均高于同一天的AD模型組和野生組,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),同一天AD模型組α7nAChR蛋白的表達(dá)較野生組明顯降低(P0.01)；三組比較有顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論 1.α7nAChR在各亞組小鼠大腦皮層細(xì)胞普遍表達(dá)。 2.阿爾茨海默病小鼠大腦皮層細(xì)胞α7nAChR的蛋白表達(dá)水平明顯降低。 3.應(yīng)用G-CSF能夠明顯增加各亞組小鼠大腦皮層細(xì)胞α7nAChR的蛋白表達(dá)水平,對(duì)阿爾茨海默病小鼠具有神經(jīng)保護(hù)功能。 第四部分G-CSF對(duì)NF-kB的表達(dá)的影響及炎癥機(jī)制的研究 目的研究G-CSF對(duì)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)的NF-kB的表達(dá)水平的影響以及NF-kB表達(dá)水平與α7nAChR表達(dá)的關(guān)系,探討α7nAChR在膽堿能通路中的關(guān)鍵地位。 方法 1.10月齡APP V717轉(zhuǎn)基因老年癡呆模型小鼠和10月齡野生小鼠,分為對(duì)照組、G-CSF治療組和野生組。對(duì)照組連續(xù)7天皮下注射PBS (phosphate belanced solution;磷酸鹽緩沖液)；G-CSF治療組連續(xù)7天皮下注射G-CSF;野生組連續(xù)7天皮下注射PBS。按照G-CSF治療完成后的天數(shù),三組小鼠又分為三個(gè)亞組：7天組、14天組、28天組。 2.小鼠分別在各時(shí)間點(diǎn)灌注多聚甲醛后取腦,免疫熒光的方法檢測(cè)小鼠大腦皮層細(xì)胞的NF-kB表達(dá)變化及G-CSF對(duì)其表達(dá)的影響。 3.用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法對(duì)小鼠大腦皮層細(xì)胞的NF-kB表達(dá)變化和a7nAChR表達(dá)變化進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果 相關(guān)性分析顯示G-CSF治療后AD模型小鼠7天組、14天組、28天組腦內(nèi)NF-kB和α7nAChR表達(dá)成負(fù)相關(guān)(7天組：r=-0.73,p=0.007；14天組：r=-0.83,p=0.008；28天組：r=-0.89,p=0.02,)。 結(jié)論 G-CSF治療后AD模型小鼠腦內(nèi)NF-kB的表達(dá)水平與α7nAChR的表達(dá)水平成負(fù)相關(guān),說(shuō)明G-CSF治療的抗炎機(jī)制是通過(guò)增加a7nAChR的表達(dá),降低了NF-kB表達(dá),從而減少致炎因子的轉(zhuǎn)錄。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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1 常洋,秦川,尹紅星,朱華,蔡有余;建立阿爾茨海默癥的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型[J];解剖學(xué)報(bào);2000年02期

2 肖雁;單可人;官志忠;;阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中β淀粉樣蛋白對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞α7尼古丁受體的影響[J];中華病理學(xué)雜志;2006年08期

本文編號(hào)：2787536