【摘要】：1.研究背景和意義腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員,BDNF在中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布,同時也表達于內分泌系統(tǒng)、骨和軟骨組織等部位,但主要海馬與皮層的含量最多。在神經(jīng)元內,BDNF主要與酪氨酸蛋白激酶受體B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)結合,激活細胞內信號通路,產生下游信號影響神經(jīng)元。當BDNF與TrkB結合時,它促進細胞增殖、分化和存活,并有助于增加多種神經(jīng)元的興奮性,BDNF也促進突觸形成、突觸傳遞。長時程增強作用(long-term potentiation,LTP)是影響突觸連接的重要因素,BDNF對此起關鍵作用。BDNF在體內首先被合成為前體物質(brain-derived neurotrophic factor precursor,proBDNF),后被細胞外纖溶酶和基質金屬蛋白酶,或細胞內激素原轉化酶和弗林蛋白酶裂解,釋放出成熟的BDNF(mBDNF)和BDNF前肽段(pBDNF)。proBDNF是BDNF的前體蛋白,研究證明proBDNF與BDNF具有截然相反的作用。proBDNF與p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)結合后抑制神經(jīng)元生成、促進腦內Aβ沉積,進而引起小鼠學習與記憶缺陷。proBDNF可與p75NTR、sortilin受體復合物結合形成功能三聚體,抑制神經(jīng)元的增殖、促進神經(jīng)元凋亡。proBDNF對神經(jīng)元的突觸傳遞、突觸可塑性具有負性調控作用,并且proBDNF可以抑制LTP,促進長時程抑制(LTD)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前肽(BDNF propeptide,pBDNF)是proBDNF前片段。pBDNF與BDNF、proBDNF一樣,在興奮性突觸前的致密中心囊泡中儲存與運輸,離體海馬神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn),pBDNF也以誘導型方式分泌。研究表明,晚期胚胎與出生后早期小鼠體內pBDNF水平微乎其微,出生5 d后,小鼠腦內可以檢測到pBDNF的存在。小鼠1月齡左右時,pBDNF水平急劇增加,在成年期(3~9月齡)pBDNF進入平臺期不再產生明顯變化。proBDNF在生長期腦內水平較高,成年期腦內則是mBDNF與pBDNF含量更加豐富,甚至在成年人腦內pBDNF水平是proBDNF的10余倍。既往認為pBDNF僅具有分子伴侶的功能,參與BDNF蛋白的正確折疊。最近研究表明,proBDNF裂解后產生的pBDNF本身有著重要作用:pBDNF能夠在海馬神經(jīng)元表達并分泌;pBDNF通過激活caspase-3途徑降低培養(yǎng)神經(jīng)元突起密度并且p75NTR是pBDNF負調節(jié)的必要條件;pBDNF通過抑制GluN2B和AMPA促進海馬LTD;Met66 pro-domain通過p75NTR/SorCS2抑制培養(yǎng)海馬神經(jīng)元生長錐。已知proBDNF與其受體p75NTR和sortilin共存于新生鼠小腦顆粒層,proBDNF可能通過同時與受體p75NTR、sortilin結合形成功能三聚體而介導小腦顆粒細胞遷移的抑制作用。而對于pBDNF的受體,目前說法不一。有研究表明,p75NTR雖不直接與pBDNF結合,但p75NTR是pBDNF起作用所必須的受體分子之一。但也有研究表示,并未檢測到pBDNF與p75NTR和SorCS2的直接結合。因此,猜測p75NTR是介導pBDNF負性調控作用的重要前提條件,但并不是直接受體。阻斷p75NTR,可能減輕pBDNF對海馬神經(jīng)元的毒性作用。因pBDNF對神經(jīng)元的影響以及作用機制尚不明確。因此,本研究擬觀察:1.pBDNF對原代培養(yǎng)神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用并探討p75NTR在其中可能介導的作用;2.pBDNF對神經(jīng)干細胞增殖的影響,并探討其中可能的機制;3.pBDNF對轉基因AD鼠學習記憶功能以及PSD-95蛋白的影響。2.材料與方法(1)CCK-8法檢測海馬神經(jīng)元存活率采用懷孕16-18天的野生型C57BL/6J孕鼠,無菌條件下取出胎鼠,分離海馬組織于96孔板中進行原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。孔內加入不同濃度(0,10,50,100,200,300ng/ml)pBDNF重組蛋白進行干預,72h后CCK-8法檢測450nm波長下光密度值(OD);然后觀察在一定濃度的pBDNF(300ng/ml)下給予p75NTR抗體(140nM),72h后CCK-8法檢測450nm波長下OD值。(2)免疫熒光染色和神經(jīng)突起長度測定培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元,加入濃度為300ng/mL的pBDNF蛋白,72h后用免疫熒光法進行MAP-2染色,imageJ軟件測量神經(jīng)元突起長度變化;同時觀察一起加入p75NTR抗體(140nM)后神經(jīng)元突起長度變化。(3)TUNEL檢測海馬神經(jīng)元凋亡培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元,加入濃度為300ng/mL的pBDNF蛋白,72h后使用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)檢測凋亡細胞;同時觀察一起加入p75NTR抗體(140nM)后凋亡細胞百分比的變化。(4)EDU檢測神經(jīng)干細胞增殖培養(yǎng)海馬神經(jīng)干細胞,接種后加入濃度為300ng/mL的pBDNF蛋白,48h后加入EDU培養(yǎng)基培養(yǎng),24h后采用EDU試劑盒進行檢測;同時觀察一起加入p75NTR抗體(140nM)后增殖細胞百分比的變化。(5)免疫印跡檢測提取原代海馬神經(jīng)元各組細胞蛋白,檢測p75NTR受體水平以及凋亡相關蛋白caspase-3、Bcl-2、Bax水平變化;提取海馬神經(jīng)干細胞各組細胞蛋白,檢測增殖相關蛋白ERK 1/2與p-ERK 1/2水平變化;提取干預后AD鼠腦組織,檢測PSD-95蛋白水平變化。(6)水迷宮實驗將AD小鼠分為三組:AAV-GFP對照組、AAV-pBDNF實驗組、AAV-pBDNF+p75NTR抗體組。所有小鼠于海馬注射4周后進行Morris水迷宮實驗來檢測其學習記憶能力的變化。3.結果(1)pBDNF對海馬原代神經(jīng)元的存活率有抑制作用,在300ng/mL時pBDNF的抑制作用較為明顯(P㩳0.05);當加入p75NTR抗體后,pBDNF的抑制作用明顯減弱(P㩳0.05)。(2)pBDNF能夠抑制原代海馬神經(jīng)元突起生長(P㩳0.05),而p75NTR抗體能夠中和pBDNF的抑制作用(P㩳0.05)。(3)pBDNF組原代海馬神經(jīng)元的TUNEL陽性細胞明顯增加,表示pBDNF組凋亡細胞百分比增加(P㩳0.05),當同時加入p75NTR抗體后,pBDNF的促凋亡作用減弱(P㩳0.05)。(4)pBDNF組海馬神經(jīng)干細胞的EDU陽性細胞明顯減少,表示pBDNF組增殖細胞百分比減少(P㩳0.05),當同時加入p75NTR抗體后,pBDNF抑制增殖作用減弱(P㩳0.05)。(5)使用pBDNF蛋白處理培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元其p75NTR受體蛋白濃度顯著增加(P㩳0.05);原代海馬神經(jīng)元pBDNF組與對照組和p75NTR抗體拮抗組相比,其caspase-3、Bax含量增加,Bcl-2含量下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P㩳0.05)。海馬神經(jīng)干細胞pBDNF組與對照組和p75NTR抗體拮抗組相比,p-ERK 1/2含量下降(P㩳0.05),而各組ERK 1/2含量無明顯差異(P0.05)。(6)經(jīng)過前5天的定位航行訓練,第5天時對照組與AAV-pBDNF+p75NTR抗體組的逃避潛伏期均較第1天有明顯下降(P0.05),而第5天pBDNF組AD鼠的逃避潛伏期雖然也較第一天有所縮短,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。在第6天檢測期空間探索實驗中,pBDNF組AD小鼠穿越平臺次數(shù)較其余兩組少(P0.05)。(7)實驗結果表明,AAV-pBDNF組AD鼠海馬內PSD-95含量較AAV-GFP組和AAV-pBDNF+p75NTR抗體組降低(P0.05),提示其神經(jīng)突觸后興奮性傳遞水平降低,pBDNF可能通過降低海馬內PSD-95的表達,進而降低AD鼠學習記憶功能。4.結論pBDNF不僅抑制原代海馬神經(jīng)元的活性,抑制其神經(jīng)元突起生長,并且促進原代神經(jīng)元凋亡,抑制海馬神經(jīng)干細胞增殖活動,表明pBDNF具有毒性作用,并且這種毒性作用可能是通過p75NTR受體介導產生。AAV-pBDNF能夠抑制AD小鼠的學習記憶功能,降低海馬內PSD-95的表達,說明pBDNF可能通過降低AD海馬內PSD-95的表達而影響AD鼠學習記憶功能。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R749.16
【圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學碩士學位論文均數(shù) 標準差的方式進行表示，兩組之 test，多組之間比較使用 one-way ANOVA 或義。經(jīng)元鑒定成功培養(yǎng)出原代海馬神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體顯。

圖 2. 小鼠新生原代培養(yǎng)細胞鑒定.2 Identification of primary hippocampal neurons. Immunofluorescence images res of hippocampal neurons. Scale bar = 50 μm..2 不同濃度梯度 pBDNF 對神經(jīng)元活性的影響以及 p75NTR 抗體對影響圖 3 所示，為了確定 pBDNF 對原代海馬神經(jīng)元存活的影響，我們分別用L、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL)處理海現(xiàn) pBDNF 對神經(jīng)元存活的抑制作用呈濃度依賴性，結果顯示 OD450在10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 時，細胞活性無明顯降低，差異無統(tǒng).05）；當濃度為 200 ng/mL 時 OD450降低，與 0 ng/mL 處 OD450比較有統(tǒng)計學意義（P 㩳0.01）。當濃度為 300 ng/mL 時 OD450進一步降低學差異具有統(tǒng)計學意義（P 㩳0.01）。說明 pBDNF 對培養(yǎng)的原代海有抑制作用，且這種作用在 200 ng/mL 時影響顯著，增加濃度會使這

. pBDNF 與 p75NTR 抗體對培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元活性影響的 CCK-8 檢測 pBDNF inhibits the viability of neurons depending on the p75NTR signaliraph shows different cell viabilities induced by different concentrations ofTR antibody (140 nM) together with pBDNF (300 ng/mL) for 72 h. (n=6 for , one-way ANOVA, **P<0.01 compared with 0 ng/mL pBDNF group,##P<0.0g/mL pBDNF group).3 pBDNF 對原代海馬神經(jīng)元突起長度的影響熒光結果顯示，加入 pBDNF（300 ng/mL）后，培養(yǎng)的野生型小突起生長長度明顯短于對照組（P＜0.01），而當 pBDNF 與 p75于新生海馬神經(jīng)元時，海馬神經(jīng)元受 pBDNF 的抑制作用有所減BDNF 組長，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。說明 pBDNF 能經(jīng)元的突起生長，并且 p75NTR 參與了這個作用。

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 楊文靜;李煜;馮延;李X爻

本文編號：2782692