【摘要】：背景：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種以智能衰退、人格改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,病程進(jìn)行性發(fā)展。病理改變主要集中在顳、前額和頂葉,其中以海馬改變最為明顯,主要病理學(xué)特征為胞內(nèi)過度磷酸化的tau蛋白所形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles. NFTs), β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)異常蓄積形成的老年斑(senile plaques, NPS)以及選擇性神經(jīng)元和突觸脫失。在早發(fā)性家族性AD患者中涉及淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein, APP)、早老素1(presenilin 1, PS1)、早老素2(presenilin 2, PS2)基因突變。但是AD發(fā)病的分子機(jī)制在很大程度上還不清楚,在神經(jīng)元纖維纏結(jié)形成前細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)能量代謝障礙、ROS生成增加,說明線粒體功能障礙以及氧化應(yīng)激是AD的早期事件,目前幾種假說主要圍繞AD發(fā)生發(fā)展的早期事件進(jìn)行研究,旨在為該疾病提供一種早期有效的臨床干預(yù)治療。自噬是細(xì)胞清除損傷的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的分解代謝過程,通過這一過程有助于細(xì)胞適應(yīng)本身代謝需要和實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器的更新。自噬主要包括巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬三種形式,按自噬是否具有選擇性又可分為選擇性和非選擇性自噬。線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行能量轉(zhuǎn)化的場所,在供給細(xì)胞能量的同時(shí)可以產(chǎn)生活性氧(ROS),過多的ROS可以引起蛋白質(zhì),核酸和脂肪酸過氧化,造成細(xì)胞損傷,因此及時(shí)清除損傷的線粒體對維持細(xì)胞正常生理功能具有重要作用。當(dāng)細(xì)胞在饑餓、氧化應(yīng)激、衰老等情況下,可以使細(xì)胞內(nèi)線粒體發(fā)生去極化,去極化的線粒體被選擇性的包裹進(jìn)自噬體并與溶酶體結(jié)合,從而使損傷的線粒體得以清除的過程稱為線粒體自噬。線粒體自噬屬于選擇性自噬。有研究表明,AD患者大腦神經(jīng)元內(nèi)存在線粒體數(shù)量減少、嵴破壞,線粒體功能障礙。Ap可以抑制細(xì)胞呼吸鏈和三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶,使線粒體功能障礙,線粒體膜電位下降,線粒體腫脹、顆粒性狀發(fā)生改變、ATP生成減少,ROS增多,造成細(xì)胞損傷。線粒體靶向絲氨酸/蘇氨酸激酶PTEN誘導(dǎo)激酶1(PTEN inducible kinase 1, PINK1)和E3泛素連接酶Parkin通過調(diào)節(jié)膜電位,嵴結(jié)構(gòu),鈣穩(wěn)態(tài),線粒體DNA的完整性和呼吸活動(dòng)等一些生理過程來維持線粒體完整性。在正常的線粒體中,PINK1被迅速降解,當(dāng)線粒體膜電位去極化后,PINKl才以電壓依賴的方式在線粒體外膜上穩(wěn)定表達(dá)。PINK1/Parkin途徑是自噬相關(guān)清除不正常線粒體的關(guān)鍵。根據(jù)以上背景所述,本研究主要探討在AD細(xì)胞模型中是否有線粒體自噬異常,線粒體自噬的作用機(jī)制是什么,PINK1和Parkin是否參與了線粒體自噬的調(diào)節(jié)。本研究旨在對AD發(fā)病早期事件——線粒體自噬的研究,為AD的早期臨床干預(yù)及防治提供新的思路及方法。目的：探討阿爾茨海默病細(xì)胞模型20E2中是否存在線粒體自噬異常,線粒體自噬的作用機(jī)制以及PINK1和Parkin是否參與了線粒體自噬的調(diào)節(jié)。為AD的早期臨床干預(yù)提供新思路及方法。方法：1.將20E2細(xì)胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APPsw的HEK293細(xì)胞)作為實(shí)驗(yàn)組,HEK293細(xì)胞作為對照組在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。2.應(yīng)用ELISA法檢測細(xì)胞上清Aβ1-40水平、Western blotting檢測APP蛋白表達(dá)水平,確定20E2細(xì)胞是否建模成功。3.電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體。4.JC-1檢測兩種細(xì)胞線粒體膜電位。5.流式細(xì)胞儀檢測兩種細(xì)胞凋亡情況。6. Western blotting檢測LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin表達(dá)水平。7.免疫熒光觀察Parkin表達(dá)及線粒體定位情況。8. PINK1 siRNA處理細(xì)胞,Western blotting檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)水平。1.與HEK293細(xì)胞相比,20E2細(xì)胞APP蛋白、Aβ1-40表達(dá)增加(P0.05)。2.20E2較HEK293細(xì)胞線粒體腫脹、嵴消失、空泡化明顯,線粒體膜電位下降。3.20E2細(xì)胞與HEK293細(xì)胞凋亡率無明顯差別(P0.05)。4.與HEK293細(xì)胞相比,20E2細(xì)胞LC3-Ⅱ、 PINK1、Parkin表達(dá)增加(P0.05)。5.免疫熒光示20E2較HEK293細(xì)胞Parkin表達(dá)增加,線粒體定位明顯。6.經(jīng)PINK1 siRNA干擾后20E2細(xì)胞LC3 Ⅱ表達(dá)減少,說明PINK1/Parkin途徑參與了20E2細(xì)胞線粒體自噬調(diào)節(jié)。結(jié)論：阿爾茨海默病細(xì)胞模型20E2線粒體形態(tài)改變明顯、膜電位下降,線粒體自噬增加,PINK1 Parkin表達(dá)增加,經(jīng)PINK1 siRNA處理后20E2細(xì)胞自噬較前減弱,研究結(jié)果表明AD細(xì)胞模型20E2這些改變可能通過PINK1、Parkin途徑引起線粒體自噬增加。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【圖文】：

完全相同的條件下培養(yǎng)兩種細(xì)胞，對數(shù)生長期的兩種細(xì)胞電鏡下觀察細(xì)胞超逡逑微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，２０Ｅ２細(xì)胞中線粒體較對照組改變明顯，線粒體腫脹，空泡化線粒逡逑體峭斷裂，正常形態(tài)消失，見圖３。逡逑ＨＥＫ２９３邐２０Ｅ２逡逑圖３電q<下觀察線粒體形態(tài)逡逑３邋ＪＣ－１檢測線粒體膜電位結(jié)果：逡逑采用完全相同的條件培養(yǎng)兩種細(xì)胞，ＪＣ－１檢測線粒體膜電位，正常情況下逡逑線粒體膜電位較高時(shí)，ＪＣ－１在線粒體基質(zhì)形成聚合物，焚光顯微鏡下可Ｗ產(chǎn)生逡逑紅色巧光；在線粒體膜電位較低時(shí)ＪＣ－１為單體，產(chǎn)生綠色英光。結(jié)果顯示；２０Ｅ２逡逑細(xì)胞較對照組紅色巧光減弱，綠色巧光增強(qiáng)，表明線粒體膜電位下降，見圖４。逡逑３１逡逑

完全相同的條件下培養(yǎng)兩種細(xì)胞，對數(shù)生長期的兩種細(xì)胞電鏡下觀察細(xì)胞超逡逑微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，２０Ｅ２細(xì)胞中線粒體較對照組改變明顯，線粒體腫脹，空泡化線粒逡逑體峭斷裂，正常形態(tài)消失，見圖３。逡逑ＨＥＫ２９３邐２０Ｅ２逡逑圖３電q<下觀察線粒體形態(tài)逡逑３邋ＪＣ－１檢測線粒體膜電位結(jié)果：逡逑采用完全相同的條件培養(yǎng)兩種細(xì)胞，ＪＣ－１檢測線粒體膜電位，正常情況下逡逑線粒體膜電位較高時(shí)，ＪＣ－１在線粒體基質(zhì)形成聚合物，焚光顯微鏡下可Ｗ產(chǎn)生逡逑紅色巧光；在線粒體膜電位較低時(shí)ＪＣ－１為單體，產(chǎn)生綠色英光。結(jié)果顯示；２０Ｅ２逡逑細(xì)胞較對照組紅色巧光減弱，綠色巧光增強(qiáng)，表明線粒體膜電位下降，見圖４。逡逑３１逡逑

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6 邵千里;15例阿爾茨海默病的診治[J];貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年03期

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9 ;腦器質(zhì)性精神障礙[J];國外科技資料目錄.醫(yī)藥衛(wèi)生;2001年04期

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5 李工博;殺蟲劑DDT和hnRNPA1基因在阿爾茨海默病中的作用及分子機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

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本文編號：2782281