【摘要】：水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)是一組廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞膜上,參與機(jī)體內(nèi)水轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜整合蛋白,主要作用于水分子的跨膜及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),目前哺乳動(dòng)物體內(nèi)已鑒定出13種水通道蛋白AQPO-AQP12[1,2]。其中AQP4在調(diào)節(jié)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),鉀離子的清除,以及水平衡上具有重要的作用。近幾年研究發(fā)現(xiàn)AQP4在垃圾的清理、細(xì)胞體積動(dòng)力學(xué)、鉀離子清除、神經(jīng)元興奮性、突觸可塑性和行為、感應(yīng)系統(tǒng)(視網(wǎng)膜、內(nèi)耳)上都有著不同的作用。作為一種膜整合蛋白,除提供基礎(chǔ)的水平衡外[3],自2003年開始就有人發(fā)現(xiàn),抑制AQP4表達(dá)可以導(dǎo)致N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA受體)失調(diào),損壞長時(shí)程增強(qiáng)作用(Long-term Potentiation,LTP),這種LTP是由θ突發(fā)誘導(dǎo),特異性的依賴于BDNF-TRKB受體[4](腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子,brain derived neurotrophic factor,BDNF;酪氨酸激酶B,TRKB)。提示AQP4與神經(jīng)營養(yǎng)因子之間存在相互聯(lián)系。截至2019年,AQP4參與調(diào)節(jié)BDNF的具體機(jī)制研究還沒有,主要是將AQP4導(dǎo)致的認(rèn)知障礙與BDNF進(jìn)行聯(lián)系[5]。從2009年提出BDNF的“陰陽平衡假說”到2018提出的“連續(xù)分選假說”,提示我們需要從整體上來評價(jià)神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用[61,并且腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的作用不僅僅局限于mBDNF-TRKB信號偶聯(lián)作用,其前體proBDNF對BDNF自身生成、分泌、剪切及整體上細(xì)胞存活,凋亡的調(diào)節(jié)也具有重要作用。同時(shí)暗示著在將來的抗抑郁和相關(guān)神經(jīng)退行性疾病中,會選用新的靶點(diǎn)和治療方式。但是目前對于proBDNF和mBDNF的研究較少,相對應(yīng)的機(jī)制研究也很缺乏,2018年在《PNAS》和《Nature》上發(fā)表的關(guān)于BDNF信號傳導(dǎo)以及信號整合的兩篇文章,提示我們BDNF的信號傳遞伴隨著多個(gè)蛋白的整合,BDNF的研究前景還有很多,但在許多領(lǐng)域仍然不清楚[7,8]。2005年Chen等人發(fā)現(xiàn),sortilin和BDNF的前體結(jié)構(gòu)域存在特異性結(jié)合[9],并且這樣的復(fù)合物形成足以影響到BDNF在細(xì)胞內(nèi)的分泌方式。2019年Jason等人發(fā)現(xiàn)改變分揀蛋白的剪接可以改變活性依賴性BDNF分泌,損害突觸可塑性和認(rèn)知行為[10],這些提示我們BDNF前體結(jié)構(gòu)域在突觸可塑性以及自身的分泌中具有不可忽視的作用。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)小鼠AQP4敲除可以改變基礎(chǔ)狀態(tài)下海馬皮層腦區(qū)BDNF表達(dá),而在抑郁模型中,AQP4基因敲除鼠的BDNF表達(dá)與野生型對比,表現(xiàn)出特異性差異,這提示我們AQP4對BDNF的調(diào)節(jié)可以影響基礎(chǔ)和疾病模型下BDNF的蛋白表達(dá)。根據(jù)AQP4在腦內(nèi)的分布及定位特點(diǎn),我們聚焦于AQP4調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF成熟體表達(dá)的機(jī)制研究,以此來說明AQP4在腦內(nèi)參與BDNF調(diào)節(jié)的相關(guān)機(jī)制。目的:探究AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞生成和分泌BDNF的過程中,調(diào)節(jié)BDNF前體及成熟體表達(dá)的具體機(jī)制研究。方法:本實(shí)驗(yàn)將雄性CD1/AQP4+/+和CD1/AQP4-/-小鼠各自隨機(jī)分成三組,共六組:AQP4+/+正常對照組,AQP4+/+CMS模型組,AQP4+/+CMS抑郁模型+氟西汀治療組,AQP4--正常對照組,AQP4--CMS模型組,AQP4-/-CMS抑郁模型+氟西汀治療組。每只小鼠單籠飼養(yǎng),對照組常規(guī)飼養(yǎng),通過糖水測試觀察是否造模成功。1.提取六組海馬、皮層腦區(qū)組織蛋白,Western blotting檢測組織中BDNF前體及成熟體的蛋白表達(dá);2.培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞,Western blotting檢測細(xì)胞內(nèi)BDNF前體及成熟體蛋白表達(dá),4同時(shí)檢測細(xì)胞分泌蛋白中BDNF前體蛋白表達(dá);3.ELISA試劑盒檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)及胞外的BDNF含量;4.QPCR檢測海馬、皮層及星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA的表達(dá);5.Wesrtern blotting檢測海馬、皮層及原代星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF上游啟動(dòng)因子β-catenin,CREB(環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白,cAMP-response element binding protein)及相應(yīng)磷酸化表達(dá);6.COIP檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞及C8細(xì)胞株內(nèi)分揀蛋白sortilin、AQP4與BDNF前體結(jié)構(gòu)域之間的相互結(jié)合作用;7.使用鈣探針fluo-3 am孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞,通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測兩種基因型星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的量,并檢測給藥后各基因型細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量;8.使用TSA偶聯(lián)的多重?zé)晒馊旧?細(xì)胞技術(shù),觀察sortilin在兩種基因型星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)與BDNF前體的結(jié)合效率。結(jié)果:1.AQP4基因敲除小鼠海馬、皮層腦組織BDNF前體和成熟體蛋白表達(dá)異常在基礎(chǔ)狀態(tài)下,AQP4敲除導(dǎo)致小鼠海馬、皮層區(qū)BDNF前體表達(dá)升高,成熟體表達(dá)降低(p0.05)。CMS造模后,AQP4+/+組海馬、皮層區(qū)BDNF前體升高,成熟體降低(p0.05);而AQP4-/-組在CMS造模后海馬、皮層區(qū)前體及成熟體未出現(xiàn)差異性變化,且取消了氟西汀的治療作用。提示AQP4調(diào)節(jié)腦內(nèi)BDNF前體及成熟體的表達(dá)。2.AQP4基因敲除導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)BDNF前體及成熟體蛋白表達(dá)異常在基礎(chǔ)狀態(tài)下,AQP4敲除導(dǎo)致原代星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)BDNF前體表達(dá)升高,成熟體表達(dá)降低(p0.05)。AQP4基因敲除未影響海馬、皮層組織中BDNF mRNA水平及上游啟動(dòng)因子CREB、β-catenin自身和磷酸化表達(dá)。QPCR分別檢測兩種基因小鼠海馬、皮層區(qū)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、GDNF、CDNF的mRNA水平。發(fā)現(xiàn)AQP4敲除未影響各營養(yǎng)因子在海馬、皮層區(qū)mRNA水平。同時(shí)在基礎(chǔ)狀態(tài)下,Western blotting檢測BDNF上游啟動(dòng)因子β-catenin,CREB及其磷酸化。發(fā)現(xiàn)AQP4敲除對腦內(nèi)β-catenin,CREB及其磷酸化水平無顯著影響。3.AQP4基因敲除未影響星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)BDNF的生成QPCR檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)AQP4敲除及對照組的BDNF mRNA水平無顯著差異。通過Western blotting檢測BDNF上游啟動(dòng)因子β-catenin,CREB及其磷酸化水平均無顯著差異。通過ELISA試劑盒檢測,發(fā)現(xiàn)AQP4-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)及胞外的BDNF總量與AQP4+/+組的BDNF總量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異。表明AQP4未參與星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF的生成。4.AQP4基因敲除抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞向外分泌BDNF ELISA試劑盒檢測給予饑餓刺激后6 h,12 h及24 h后的胞外BDNF含量,發(fā)現(xiàn)AQP4基因敲除導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞向胞外分泌BDNF的量減少,從饑餓12 h開始出現(xiàn)顯著性差異(p0.05)。Western blotting檢測細(xì)胞上清蛋白,發(fā)現(xiàn)BDNF前體分泌減少(p0.01)。5.AQP4基因敲除導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌BDNF減少與細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量相關(guān)AQP4敲除可以導(dǎo)致細(xì)胞上鈣離子通道蛋白表達(dá)減少(實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果);給予NMDA、AMPA受體抑制劑可以恢復(fù)AQP4-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF分泌異常;鈣離子通道阻斷劑可以導(dǎo)致AQP4+/+星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF分泌減少。通過流式細(xì)胞檢測,在基礎(chǔ)狀態(tài)下AQP4敲除的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi),鈣離子含量高于對照組。NMDA、AMPA受體阻斷劑給藥后可以降低AQP4-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)的鈣含量,表明AQP4-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞因NMDA,AMPA受體過度活化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平過高。6.AQP4基因敲除抑制sortilin與BDNF前體結(jié)構(gòu)域的結(jié)合AQP4-/-和AQP4+/+星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)sortilin的蛋白表達(dá)無顯著差異。在基礎(chǔ)狀態(tài)下,AQP4-/-星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)sortilin與BDNF前體結(jié)構(gòu)域的結(jié)合減少(p0.05)。表明AQP4抑制sortilin與BDNF前體結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。結(jié)論:AQP4基因敲除升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平及減弱sortilin與BDNF前體的結(jié)合,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞向外分泌前體BDNF。導(dǎo)致細(xì)胞間隙參與剪切的前體BDNF減少,最終導(dǎo)致成熟體生成減少,從而改變細(xì)胞及海馬、皮層腦區(qū)中BDNF前體及成熟體的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R749.1

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本文編號：2772091