【摘要】：成癮被認(rèn)為是一種病態(tài)的學(xué)習(xí)、記憶過程,表現(xiàn)為失控的主動尋藥和強(qiáng)迫性用藥行為。突觸可塑性作為學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ),在成癮行為的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。伏隔核(nucleus accumbens,NAc)是大腦獎賞系統(tǒng)的重要組成部分,參與機(jī)體認(rèn)知活動、學(xué)習(xí)記憶相關(guān)行為活動,被認(rèn)為是機(jī)體產(chǎn)生獎賞效應(yīng)的主要核團(tuán)。第Ⅲ類去乙�；赋聊畔⒄{(diào)節(jié)因子2蛋白(Silent information regulator2 proteins,Sirtuins)以組蛋白和非組蛋白作為去乙酰化酶底物,調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,也參與可卡因、嗎啡等精神興奮類藥物的成癮形成。沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子同源類似物1(Silent mating type information regulation 2homolog 1,SIRT1)是人類Sirtuins家族中研究最為廣泛深入的蛋白,然而有關(guān)SIRT1在海洛因成癮大鼠NAc中的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立海洛因成癮大鼠模型,檢測Sirtuins在海洛因成癮大鼠NAc中的表達(dá)情況;包裝含有目的基因Sirt1和沉默Sirt1基因的腺相關(guān)病毒,并對大鼠NAc進(jìn)行微量注射轉(zhuǎn)染,建立海洛因成癮、SIRT1過表達(dá)以及SIRT1沉默大鼠模型,觀察各組大鼠海洛因條件位置偏愛(conditioned place preference,CPP)的誘導(dǎo)情況和納洛酮戒斷等癥狀;利用PCR芯片技術(shù)檢測海洛因成癮大鼠,SIRT1過表達(dá)大鼠NAc中與突觸可塑性相關(guān)的84個基因的表達(dá)變化;采用免疫組織化學(xué)和免疫蛋白印跡技術(shù)檢測各組大鼠NAc中突觸可塑性相關(guān)蛋白的定位和表達(dá)情況;用透射電鏡對突觸超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。以期闡明SIRT1在海洛因成癮機(jī)制中的可能作用,以及調(diào)控SIRT1的表達(dá)對伏隔核突觸可塑性的影響,為找尋戒毒或治療成癮尋找新的靶點(diǎn)。第一部分:Sirtuins在海洛因成癮大鼠NAc腦區(qū)中的表達(dá)目的:通過建立大鼠海洛因成癮模型,誘導(dǎo)大鼠海洛因條件位置偏愛(CPP)的形成,檢測Sirtuins成員SIRT1-SIRT7在NAc腦區(qū)的表達(dá)情況。方法:(1)成年雄性sd(sprague-dawley)大鼠隨機(jī)分為鹽水對照組、海洛因成癮組和納洛酮戒斷組。海洛因成癮組按體重逐日遞增腹腔注射海洛因藥液,直至第9d成功建立大鼠成癮模型;第10d注射納洛酮催促戒斷,觀察并記錄戒斷癥狀之后處死動物。取各組大鼠nac腦區(qū),分別用westernblot技術(shù)和實(shí)時熒光定量pcr技術(shù)檢測sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6和sirt7蛋白和mrna的表達(dá)。(2)sd大鼠分為cpp組和鹽水對照組,cpp組大鼠每日上午按照標(biāo)準(zhǔn)遞增給予海洛因后放入白箱,下午注射相當(dāng)劑量生理鹽水放入黑箱進(jìn)行訓(xùn)練連續(xù)9d;生理鹽水組上、下午都給予生理鹽水。最后記錄大鼠在白箱的停留時間,檢測海洛因誘導(dǎo)cpp的情況。結(jié)果:(1)海洛因成癮組和生理鹽水組經(jīng)過連續(xù)注射海洛因或生理鹽水9d后給予納洛酮后,觀察到海洛因成癮組大鼠在納洛酮作用下,出現(xiàn)明顯的站立、跳躍、扭體、濕狗樣抖、眼瞼下垂、齒顫和腹瀉等戒斷癥狀(p0.05)。而生理鹽水組未見明顯戒斷反應(yīng);(2)經(jīng)過預(yù)測試期、訓(xùn)練期和測試期,給予海洛因組大鼠明顯誘發(fā)cpp,其在白箱停留時間明顯長于生理鹽水對照組(p0.05)。(3)westernblot結(jié)果顯示,海洛因成癮大鼠nac腦區(qū)中sirt1蛋白的表達(dá)明顯高于生理鹽水組(p0.05),而sirt2-sirt7蛋白水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)qrt-pcr結(jié)果顯示,海洛因成癮大鼠nac腦區(qū)sirt1mrna水平顯著升高,而sirt2-sirt7mrna表達(dá)在海洛因成癮組和生理鹽水組之間無明顯差異。結(jié)論:在海洛因成癮大鼠nac中,sirtuins家族的sirt1在蛋白和mrna水平能明顯升高,提示sirt1參與了海洛因成癮過程的形成。第二部分:sirt1對突觸可塑性相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的影響目的:通過建立不同的實(shí)驗(yàn)動物模型,觀察大鼠行為學(xué)改變,檢測突觸可塑性相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)情況,了解sirt1對各組大鼠nac腦區(qū)突觸可塑性的影響,探討突觸可塑性與成癮行為變化的可能關(guān)系。方法:包裝raav9-rsirt1和raav9-rsirt1shrna腺相關(guān)病毒,利用轉(zhuǎn)染技術(shù),建立海洛因成癮組、sirt1過表達(dá)組、sirt1沉默組大鼠模型;觀察納洛酮戒斷癥狀和cpp變化;利用pcr基因芯片技術(shù)檢測海洛因成癮大鼠和sirt1過表達(dá)大鼠nac腦區(qū)中與突觸可塑性相關(guān)的84個基因的表達(dá)變化;應(yīng)用免疫組織化學(xué)和圖像分析技術(shù)檢測SIRT1作用底物總體乙�；M蛋白H3(Acetyl-Histone H3,Ac-H3)以及一些非組蛋白底物(Cdk5,NF-κB等)的定位和平均光密度;運(yùn)用Western blot技術(shù)檢測突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá);透射電鏡觀察突觸的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建質(zhì)粒,包裝含目的基因和沉默目的基因的腺相關(guān)病毒并完成病毒轉(zhuǎn)染;(2)CPP行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鹽水對照組和單純病毒組大鼠訓(xùn)練前后在伴藥箱停留時間無明顯差異,海洛因成癮組、SIRT1過表達(dá)組大鼠經(jīng)訓(xùn)練后在伴藥箱停留時間明顯長于訓(xùn)練前(P0.05),海洛因CPP誘導(dǎo)成功。SIRT1沉默組大鼠在伴藥箱停留時間長于訓(xùn)練前,但較成癮和過表達(dá)組有明顯降低(P0.05)。(3)納洛酮戒斷癥狀明顯出現(xiàn)在海洛因成癮組和過表達(dá)組,尤以過表達(dá)最為典型;沉默組戒斷癥狀有所減輕;(4)免疫組織化學(xué)和Western blot結(jié)果顯示SIRT1作用底物:Ac-H3和FOXO1在海洛因成癮組表達(dá)降低(P0.05),SIRT1過表達(dá)時進(jìn)一步降低,SIRT1沉默組表達(dá)有所升高(P0.05);Cdk5、NF-κB、PSD95、Syn的表達(dá)的在海洛因成癮組表達(dá)增強(qiáng)(P0.05),SIRT1過表達(dá)時進(jìn)一步升高,SIRT1沉默組表達(dá)有所下降(P0.05);△FosB的表達(dá)在海洛因成癮組、SIRT1過表達(dá)組和SIRT1沉默組表達(dá)均升高(P0.05),但三組之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)透射電鏡觀察海洛因成癮組大鼠和SIRT1過表達(dá)組大鼠NAc中突觸數(shù)量有所增加(P0.05),突觸結(jié)構(gòu)不清晰,突觸前膜內(nèi)線粒體有腫脹,突觸間隙增寬,突觸后膜致密物增厚。結(jié)論:(1)NAc腦區(qū)SIRT1與突觸可塑性相關(guān)基因參與了調(diào)節(jié)海洛因成癮的過程。(2)NAc腦區(qū)SIRT1過表達(dá)增強(qiáng)了大鼠的行為敏化,而SIRT1沉默組減輕海洛因成癮大鼠的戒斷癥狀和CPP,有助于為戒毒治療尋找新的有效靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R749.64
【圖文】：

貴州醫(yī)科大學(xué) 2017 屆科學(xué)學(xué)位博士研究生學(xué)位論文區(qū)(ventral tegmental area,VTA)、伏隔核(nucleus accumbens,NAc)、前額prefrontal cortex,PFC）是腦內(nèi)產(chǎn)生獎賞效應(yīng)的主要核團(tuán)[10]。NAc主要中腦邊緣系統(tǒng)腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）多巴胺神經(jīng)元(dopamine, DA)投射傳匯集前額葉皮層、海馬、杏仁核等部位興奮性谷氨酸能神經(jīng)元的傳入末同來源的信息經(jīng)過整合后通過傳出神經(jīng)元支配基底神經(jīng)節(jié)參與認(rèn)知活動感、學(xué)習(xí)記憶相關(guān)行為活動。此外NAc中的大量中等樹突棘神經(jīng)元的信能投射回PFC和中腦多巴胺系統(tǒng)[11]（圖1-1）。NAc是一個信息整合、協(xié)調(diào)成癮相關(guān)的行為學(xué)改變中起著至關(guān)重要的作用，是許多成癮性藥物的。

貴州醫(yī)科大學(xué) 2017 屆科學(xué)學(xué)位博士研究生學(xué)位論文 25 cm × 30 cm × 70 cm）。箱內(nèi)有兩塊高 30 cm 的可抽取隔板將箱部分。實(shí)驗(yàn)箱位于箱體兩側(cè)，一黑一白，是兩個大小相同的正方體壁皆為白黑相間條紋，底面刻有條紋；黑箱內(nèi)四壁皆為黑色，底之間有一個較小的中間箱。當(dāng)隔板抽出時，大鼠可以在三個箱子之當(dāng)隔板插入時，可將動物限制在某一個箱子里。每個箱頂端都安裝頭與計(jì)算機(jī)相連，可以記錄動物在各箱中的停留時間。整個實(shí)驗(yàn)過風(fēng)，箱內(nèi)的光線、氣味等環(huán)境條件一致。

圖 1-5 蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig1-3 The standard curve of protein content從圖1-3可以看出，蛋白濃度與吸光度呈現(xiàn)較好的的線性關(guān)系，OD值)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算樣品中的蛋白含量。3） 注意事項(xiàng)：a.在BCA工作液配制過程中，應(yīng)防止A液和B液的相互污染。工，應(yīng)在24小時內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。配制好后立即加蓋，且整個過程嚴(yán)b.每個蛋白梯度和樣品均做復(fù)孔，每次都應(yīng)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣的蛋白濃度。4）Western blot 檢測：1）制備十二烷基磺酸鈉——聚丙烯酰胺(SDS-PAGE) 凝膠：裝好玻璃板，根據(jù)目的蛋白分子量大小按照凝膠配制比例（表制相應(yīng)濃度的分離膠，充分混勻后灌入凝膠玻璃槽中（灌膠時沿

【參考文獻(xiàn)】

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1 史s惚

本文編號：2760226