【摘要】：研究背景:高級糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是糖尿病的重要致病物質(zhì),并且在阿爾茨海默病(AD)的發(fā)生和發(fā)展中也起著重要的推進作用。它可以促進微管相關(guān)蛋白Tau蛋白的過度磷酸化和β-淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積。而糖尿病中另一致病因子巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)也被發(fā)現(xiàn)相對于同齡正�；颊咴贏D患者和輕度認識障礙(MCI)患者的腦脊液中會顯著增高。MIF的缺失也可以減弱Tau蛋白的過度磷酸化。研究目的:1.AGEs對MIF的影響研究及分子機制研究。2.MIF抑制劑ISO-1在AGEs進一步損傷AD細胞模型的保護作用研究。研究方法:1.體外培養(yǎng)PC12細胞,用AGEs處理PC12細胞,實時熒光定量PCR(qRT-PCR)及免疫印跡法(Western Blot,WB)檢測細胞中MIF的mRNA和蛋白表達,設(shè)空白對照組和BSA對照組。2.體外培養(yǎng)PC12細胞,AGEs處理PC12細胞,分別加入?基因結(jié)合核因子(nuclear factor-k-gene binding,NF-?B)抑制劑、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)抑制劑、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)抑制劑、磷脂酶C(phospholipase C,PLC)抑制劑、高級糖基化終末產(chǎn)物受體(the receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)抑制劑,qRT-PCR法檢測細胞中MIF的mRNA表達,設(shè)空白對照組和AEGs對照組。3.MTT法篩選Aβ_(1-40)的最適濃度和最佳給藥時間,建立AD細胞模型。CCK-8法篩選AGEs最適濃度。AGEs和ISO-1作用于Aβ_(1-40)誘導(dǎo)的PC12細胞,倒置顯微鏡下觀察細胞數(shù)目和形態(tài),qRT-PCR法檢測白介素1β(interleukin 1beta,IL-1β)、白介素6(interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的mRNA表達。研究結(jié)果:1.BSA作為對照組和空白對照組并沒有顯著差異。而與空白對照組相比,AGEs濃度200μg/ml、300μg/ml兩組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),MIF mRNA表達有明顯升高。AGEs濃度100μg/ml、300μg/ml兩組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),MIF蛋白表達有明顯升高。2.與AEGs對照組相比較,加入NF-kB抑制劑、MAPK抑制劑、RAGE抑制劑、PLC抑制劑后MIF的mRNA表達分別有不同程度下降(P0.05)。3.倒置顯微鏡100×下可見正常對照組PC12細胞樹突多而長,緊貼瓶底,細胞密集,結(jié)構(gòu)清晰且核仁可見,細胞增殖快。與對照組相比Aβ_(1-40)造模組細胞增殖受到抑制,細胞數(shù)減少,細胞間連接松弛且部分樹突縮回,核仁部分可見。經(jīng)過AGEs處理細胞后,細胞增殖進一步受到抑制,大量細胞浮起變圓,細胞碎片較多。貼壁細胞失去正常神經(jīng)細胞特征。而先經(jīng)過ISO-1預(yù)處理后可見細胞增殖的抑制作用顯著減弱,細胞數(shù)目增多,漂浮細胞減少且貼壁細胞形態(tài)良好,細胞間連接增多,樹突變長變多。AGEs促進了Aβ_(1-40)誘導(dǎo)的PC12細胞構(gòu)建的AD模型細胞的損傷和凋亡以及炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6和TNF-α的表達,AGEs和ISO-1共同作用可明顯提高AD細胞模型的細胞生存率、下調(diào)炎癥介質(zhì)的表達水平(P0.05)。研究結(jié)論:1.AGEs促進細胞模型MIF的表達。2.AGEs促進MIF表達的分子學(xué)機制可能是通過NF-kB信號通路、MAPK信號通路、PI3K信號通路、PLC信號通路來實現(xiàn)的。3.ISO-1降低了AGEs對AD細胞模型的損傷作用,其機制可能是AGEs介導(dǎo)MIF表達促進AD細胞模型的神經(jīng)炎癥,而ISO-1降低了其神經(jīng)炎癥介質(zhì)的表達。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R749.16
【圖文】：

圖 2.1AGEs 對 MIF mRNA 表達的影響The effect ofAGEs on the expression of MIF mRNA不同濃度 AGEs 處理 PC12 細胞，測得 MIF mRNA 相對表達水平，顯示的表達。數(shù)據(jù)以x±S 表示，n=3，**P<0.01 and *P<0.05。2.3.2AGEs 對 MIF 的 蛋白表達的影響為了探討 AGEs 是否影響 MIF 蛋白的表達，用不同濃度24 小時后提取蛋白檢測 MIF 蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，與濃為 100μg/ml、300μg/ml 兩組具有統(tǒng)計學(xué)差異，MIF 蛋白表2.2)。表明 AGEs 可以促進 MIF 蛋白的表達。AMIFGAPDH

圖 2.2AGEs 對 MIF 蛋白表達的影響Effect ofAGEs on the expression of MIF prote不同濃度 AGEs 處理 PC12 細胞，測得 MIF 蛋白的相對表達水平，的表達。數(shù)據(jù)以x±S 表示，n=3，**P<0.01 and *P<0.05。2.4 討論近年來研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病通過引起胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通生，而胰島素抵抗和 2 型糖尿病可能與 AD 的高發(fā)病率具主要影響執(zhí)行能力和學(xué)習(xí)記憶能力，其損害程度較 1 型糖尿病時間越長以及血糖控制不穩(wěn)定，其認知功能減退越明及新型長效胰高血糖素樣肽-1(glucagon-likepeptide1, GLP-患者的認知功能[30]。一項關(guān)于糖尿病伴 AD 小鼠的研究發(fā)鼠，糖尿病伴 AD 小鼠的 Tau 蛋白和 Aβ的積累增加。表明

高級糖基化終末產(chǎn)物促進巨噬細胞遷移抑制因子表達介導(dǎo)神經(jīng)炎癥在阿爾計量資料數(shù)據(jù)以(x±S)表示。3.3 實驗結(jié)果3.3.1AGEs 處理 PC12 細胞的最適濃度與對照組相比，隨著 AGEs 濃度的增加，細胞的存活細胞狀態(tài)，AGEs 100μg/ml、200μg/ml 濃度時細胞貼壁良300μg/ml 濃度時有部分細胞懸浮，狀態(tài)欠佳，400μg/ml 濃浮。經(jīng) GraphPad Prism 5 軟件計算出 AGEs 處理細胞(concentration for 50% of maximal effect, EC50) 為 335.0μg用 AGEs 處理細胞的濃度為 300μg/ml。

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相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2753613