【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)和糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是常見的、危害中老年人健康和生命安全的兩種疾病。近年來的流行病學調查顯示AD和DM之間存在顯著關聯(lián)。研究顯示,DM患者AD的發(fā)生率較正常人群高出2-5倍。相應的,AD患者也有DM的高發(fā)風險。糖代謝紊亂,增加了認知功能損害或者癡呆發(fā)生,尤其是老年癡呆的主要類型--AD的高發(fā)危險因素。此外,AD患者腦細胞葡萄糖與能量代謝顯著降低、而且明顯早于臨床癥候和特征性病理損害的形成。動物實驗研究也提示腦細胞葡萄糖代謝異�？赡苁茿D病理生理發(fā)生的關鍵因素。因而,AD有“Ⅲ型糖尿病”或“腦胰島素抵抗”之稱。但是到目前為止,糖代謝紊亂誘發(fā)或加重阿爾茨海默病病理損害的具體機制尚未明了。 AD是一種中樞神經系統(tǒng)退行性疾病,臨床上以進行性的認知功能損傷和特征性的病理學改變?yōu)橹饕卣鳌D的病理學特征包括腦細胞內神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFT)和細胞外老年斑(senile plaques,SP)形成。SP主要是由β-淀粉樣多肽(β-amyloid peptide, Aβ)的沉積形成,Aβ是其前體蛋白APP裂解的小分子片段,分子量為4kDa左右。Aβ具有神經元毒性,Aβ沉積和隨后的老年斑形成被認為是AD發(fā)生的最主要的原因。糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是參與糖代謝的主要限速酶之一。GSK-3在腦中高表達,除了參與糖代謝外,還與很多生理病理學過程相關。有趣的是,近年來的研究發(fā)現(xiàn),GSK-3也是參與AD發(fā)病過程的重要因素。有人通過對APP過表達的AD模型鼠的研究證實,抑制GSK-3的活性可以有效減少Aβ的產生和沉積。我們課題組先前用苯磷硫胺對APP/PS1雙轉基因動物模型進行干預研究,結果發(fā)現(xiàn)苯磷硫胺能夠明顯提高GSK-3的磷酸化水平,降低GSK-3α和GSK-3β的活性,減輕AD病理損害及改善行為學表現(xiàn)。這里,我們利用HEK293APPsw過表達細胞系,探討高糖環(huán)境是否能夠增加Aβ的產生,以及苯磷硫胺體外干預是否也通過抑制GSK-3活性來減少Aβ產生。 第一部分：高糖加劇HEK293APPsw過表達細胞β-淀粉樣多肽產生 一、不同糖濃度對HEK293細胞及HEK293APPsw過表達細胞β-淀粉樣多肽產生的影響 目的：研究不同糖濃度對HEK293APPsw過表達細胞及HEK293細胞產生Aβ的影響。 方法：選取人胚腎細胞(HEK293)及APP過表達的人胚腎細胞(HEK293APPsw過表達細胞)為實驗細胞,不同糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)作為實驗條件。使用含不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)液(終濃度分別為lg/L、3g/L、4.5g/L、5.5g/L、6.5g/L、7.5g/L、8.5g/L、10.5g/L)培養(yǎng)HEK293APPsw過表達細胞,并分別取培養(yǎng)不同時間點(6、12、24h)上清液,進行ELISA法檢測不同糖濃度、不同時間點Aβ產生情用1g/L、5.5g/L糖濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)HEK293APPsw過表達細胞及人胚腎細胞(HEK293細胞)12h,收取上清液進行ELISA法檢測,對比不同細胞系Aβ產生情況。 結果：HEK293APPsw過表達細胞較其載體細胞HEK293細胞Aβ產生明顯增多,驗證了細胞株的成功轉染。 隨著細胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的增加,HEK293APPsw過表達細胞Aβ產生量呈現(xiàn)先增加后減少的特點,葡萄糖濃度為5.5g/L培養(yǎng)液在12小時培養(yǎng)后Aβ產生到達最高峰。統(tǒng)計學數(shù)據顯示,培養(yǎng)液中糖濃度在5.5g/L與lg/L時,HEK293APPsw過表達細胞Aβ產生量在6和12小時培養(yǎng)后有顯著的統(tǒng)計學差異,6小時時間點p0.05,12小時時間點Aβ產生量達到高峰,P0.01,而在培養(yǎng)24小時后Aβ產生量不具有統(tǒng)計學差異。 不同糖濃度(1g/L與5.5g/L)對HEK293細胞Aβ產生沒有影響(P0.05)。 結論：HEK293APPsw過表達細胞較其載體細胞HEK293細胞Aβ產生明顯增多,驗證了細胞株的成功轉染。不同糖濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)對HEK293APPsw過表達細胞產生Aβ有顯著影響,呈現(xiàn)先增高、后降低的特點：5.5g/L糖濃度DMEM在12小時培養(yǎng)后較1g/L糖濃度DMEM在12小時培養(yǎng)后Aβ產生明顯增加,最具有統(tǒng)計學差異。而不同糖濃度對HEK293細胞沒有影響。 二、高糖對HEK293APPsw過表達細胞增殖與毒性的影響 目的：研究不同糖濃度對HEK293APPsw過表達細胞增值及毒性作用。 方法：選取HEK293APPsw過表達細胞為實驗細胞,不同糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)作為實驗條件。在不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)液(終濃度分別為1g/L、3g/L、4.5g/L、5.5g/L)培養(yǎng)HEK293APPsw過表達細胞,取12h上清液,爾后應用CCK-8試驗檢測細胞的活性。 結果：隨著細胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的增加(1g/L、3g/L、4.5g/L、5.5g/L),HEK293APPsw細胞Aβ產生量呈現(xiàn)增加趨勢,但是生長抑制率無明顯增加趨勢,P0.05,不具有統(tǒng)計學差異。也就是說糖濃度在一定范圍內增加(1g/L、3g/L、4.5g/L、5.5g/L)對HEK293APPsw過表達細胞不具有毒性作用。 結論：不同糖濃度的DMEM培養(yǎng)基(葡萄糖終濃度為1g/L、3g/L、4.5g/L、5.5g/L)培養(yǎng)HEK293APPsw過表達細胞12小時,對HEK293APPsw過表達細胞活性影響不具有統(tǒng)計學差異。綜上,構建理想的HEK293APPsw過表達細胞培養(yǎng)條件,為后續(xù)的實驗研究奠定了基礎。 第二部分：苯磷硫胺減少HEK293APPsw過表達細胞β-淀粉樣多肽產生 目的：觀察苯磷硫胺是否減少HEK293APPsw過表達細胞Aβ產生。 方法：基于上述研究,HEK293APPsw細胞葡萄糖濃度為5.5g/LDMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)時間為12小時Aβ產生量最多。因此取HEK293APPsw過表達細胞,隨機分為4組：(1)對照組(Con),細胞不經過藥物處理,僅在含葡萄糖5.5g/L培養(yǎng)液中加入苯磷硫胺配制液培養(yǎng)12小時；(2)苯磷硫胺10μ g/ml組(BT10),在含糖為5.5g/L培養(yǎng)液中加入苯磷硫胺,使其終濃度為10μ g/ml,培養(yǎng)12小時；(3)苯磷硫胺20μ g/ml組(BT20),在含糖為5.5g/L培養(yǎng)液中加入苯磷硫胺,使其終濃度為20μ g/m1,培養(yǎng)12小時；(4)苯磷硫胺40μ g/ml組(BT40),在含糖為5.5g/L培養(yǎng)液中加入苯磷硫胺,使其終濃度為40μ g/m1,培養(yǎng)12小時;應用ELISA檢測試劑盒檢測不同藥物濃度對Aβ產生的影響。 結果：苯磷硫胺20μ g/m1組和40μ g/ml組均能顯著減少Aβ產生。與對照組相比,40μ g/ml組P0.01,20μ g/ml組P0.05；苯磷硫胺10μ g/ml組,有使Aβ產生減少的趨勢,但與對照組(Con)相比,不具有顯著的統(tǒng)計學差異性。結論：苯磷硫胺顯著減少HEK293APPsw過表達細胞Aβ產生,一定范圍內隨著藥物劑量的增加抑制作用也隨之增加。 第三部分：高糖增加β-淀粉樣蛋白產生和苯磷硫胺干預與調制糖合酶激酶-3活性的機制研究 目的：研究高糖增加HEK293APPsw過表達細胞Aβ產生及苯磷硫胺減少HEK293APPsw過表達細胞Aβ產生與GSK-3活性的相關性。 方法：選取HEK293APPsw過表達細胞為實驗細胞,隨機分為3組：(1)低糖對照組,含葡萄糖1g/L的培養(yǎng)基加入苯磷硫胺配制液培養(yǎng)HEK293APPsw過表達細胞12小時；(2)高糖對照組,含葡萄糖5.5g/L的培養(yǎng)基加入苯磷硫胺配制液培養(yǎng)HEK293APPsw過表達細胞12小時；(3)BT40組,在含糖為5.5g/L培養(yǎng)液中加入苯磷硫胺,使其終濃度為40μ g/ml,培養(yǎng)12小時。收集細胞提取蛋白,Western blot檢測p-GSK-3α,GSK-3α,p-GSK-3β,GSK-3β表達量,比較各組間p-GSK-3α/GSK-3α, p-GSK-3β/GSK-3β比值變化,并采用酶活性檢測試劑盒檢測GSK-3α和GSK-3β的活性,比較各組間酶活性變化。 結果:Western blot結果示高糖對照組較低糖對照組p-GSK-3α/GSK-3α比值減少,有顯著的統(tǒng)計學差異(P0.01),高糖對照組較低糖對照組p-GSK-3β/GSK-3β比值減少,有統(tǒng)計學差異(P0.05),但是BT40組較高糖對照組p-GSK-3α/GSK-3α比值,及p-GSK-3β/GSK-3β比值有增加趨勢,但是沒有統(tǒng)計學差異。酶活結果示高糖對照組較低糖對照組GSK-3α、GSK-3β活性增加,有顯著的統(tǒng)計學差異(P0.05),BT40組較高糖對照組GSK-3α、GSK-3β活性均降低,有明顯的統(tǒng)計學差異(P0.05)。 結論：高糖對照組較低糖對照組GSK-3α、GSK-3β活性增加,p-GSK-3α/GSK-3α、 p-GSK-3β/GSK-3β比值顯著降低,表明GSK-3可能參與高糖加重HEK293APPsw過表達細胞Aβ產生的機制,BT40組較對照組GSK-3α、GSK-3β活性均降低,表明苯磷硫胺能夠減少HEK293APPsw過表達細胞Aβ產生可能和GSK-3的活性相關。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R749.16;R587.1

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本文編號：2753568