【摘要】：背景阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD),一種神經(jīng)退行性疾病,是威脅人類健康的重大疾病之一。近些年來,雖然AD的發(fā)病機(jī)制和治療方法取得了一定的研究進(jìn)展,目前尚無有效治療方法。隨著微生態(tài)學(xué)發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群是和機(jī)體協(xié)同進(jìn)化的微生物群體,它的改變會影響宿主健康,宿主菌群與寄主是互利共生的關(guān)系,被稱為“超級有機(jī)體”。腸道微生物在宿主腸道與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的互相應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,故此提出腦腸軸理論。很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病和精神疾病都存在微生物組群的變化,因此我們可以通過改變腸道微生物的組成,尋求治療神經(jīng)退行性疾病的新策略。研究發(fā)現(xiàn)益生菌、益生元對神經(jīng)性疾病的調(diào)節(jié)和治療效果在病情前期有較好的效果。糞菌移植(Fecal microbiota transplantation,FMT)可以調(diào)節(jié)腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)。本研究在對正常小鼠和AD小鼠的腸道微生物差異分析的基礎(chǔ)上,以正常小鼠為供體對AD小鼠進(jìn)行糞菌移植,檢測糞菌移植能否緩解AD小鼠的病理特征,提高學(xué)習(xí)記憶能力,并探討其潛在的分子機(jī)制。目的本課題通過16SrDNA高通量測序分析野生型小鼠和AD小鼠腸道微生物差異,利用糞菌移植的方法研究腸道微生物的改變對AD小鼠的影響,以期以腸道微生物為切入點(diǎn),為AD的診斷、預(yù)防和治療提供新的思路和方法。方法第一部分:正常小鼠和AD小鼠腸道微生物的差異分析野生型(wide type,WT)小鼠為WT組(n=5);APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠,為App~+組(n=5)。收集各組每小鼠糞便進(jìn)行,采用高通量測序分析AD鼠與正常小鼠之間的物種組成和群落結(jié)構(gòu)差異。第二部分:糞菌移植對AD小鼠的影響1.動(dòng)物分組及糞菌移植:APP695V717I轉(zhuǎn)基因AD小鼠的鑒定、飼養(yǎng),隨機(jī)選取15只,分為App~-組(n=5)、App~+組(n=5)、3月齡AD小鼠糞菌移植組(FMT)(n=5),對FMT組小鼠糞菌移植干預(yù)4周,期間每周測量小鼠體重變化情況,干預(yù)結(jié)束后,各組小鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。2.糞菌移植后AD鼠腸道菌群的變化:無菌環(huán)境下收集野生組小鼠、AD組、糞菌移植組三組小鼠糞便,使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測序,分析糞菌移植后AD鼠腸道微生物物種組成和群落結(jié)構(gòu)差異。3.糞菌移植對AD鼠治療作用的分子機(jī)制:剛果紅染色法觀察小鼠腦內(nèi)β淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)沉積的變化情況;免疫熒光檢測小鼠海馬組織APP蛋白的表達(dá)情況;Western Blot和RT-PCR檢測衰老相關(guān)蛋白(p16、p21、p53、sirt1、sirt2、pcna)、和炎性因子(IL-10、IL-1β,TNF-α)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT3、BDNF、NGF)以及APP蛋白在蛋白水平及基因水平表達(dá)量的變化;ELISA檢測血清SOD活性、MDA含量。結(jié)果第一部分正常小鼠和AD小鼠腸道微生物的差異分析測序結(jié)果顯示,與正常小鼠相比,AD鼠腸道菌群多樣性降低,在各分類水平上的相對豐度存在差異。LEfSe分析結(jié)果表明在微生物各分類水平上WT組和AD組中有差異顯著的Biomarker。具體表現(xiàn)在:Bacteroidales group、Ruminococcus、Firmicutes bacterium、Prevotellaceae4個(gè)類群是WT組中特異的微生物物種;Verrucomicrobiaceae、Akkermansia、Peptostreptococcaceae、Romboutsia、Lactobacillus animalis、Lactobacillales、Bacilli是AD小鼠中特異的微生物物種。第二部分糞菌移植對AD小鼠的影響1.門水平上,FMT組較AD組中Firmicutes相對豐度較少顯著增高,接近WT組;在綱水平上,與AD組相比,FMT組中Erysipelotrichia、Clostridia、Bacteroidia相對豐度增加,而Verrucomicrobia、Clostridia、Bacteroidia相對豐度降低;目水平上,FMT組Bacteroidales顯著降低;科水平上FMT組中Erysipelotrichaceae豐度顯著增加;屬水平上,糞菌移植后AD鼠腸道內(nèi)Allobaculum增加,而Ruminococcus顯著減少,WT組沒有Romboutsia,FMT組Romboutsia的相對豐度幾乎為零,然而在AD組卻見一定豐度的Romboutsia;種水平上,FMT組中Lactobacillus-animalis幾乎降低為零。2.與App~+組小鼠相比,FMT組小鼠在行為學(xué)方面表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)(P0.05)。3.糞菌移植后AD鼠血清中SOD活性增高、而海馬組織中抑炎性因子IL-10相對表達(dá)量增高、促炎因子IL-1β,TNFα等相對表達(dá)水平降低(P0.05)、衰老相關(guān)蛋白及基因p16、p21等的相對表達(dá)量降低(P0.05)、神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NT3、NGF等的相對表達(dá)量增高(P0.05)、APP蛋白相對表達(dá)量及Aβ淀粉樣蛋白沉積減少(P0.05)。結(jié)論1.與野生型小鼠相比,AD小鼠腸道微生物多樣性降低,物種豐度也存在顯著差異。2.糞菌移植使AD小鼠腸道微生物在各分類水平物種豐度更趨向于WT組。糞菌移植使AD小鼠在行為學(xué)方面的認(rèn)知功能得到改善,抗氧化損傷能力提高,減輕炎性反應(yīng)水平,促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育、存活,減少Aβ淀粉樣蛋白沉積,在一定程度上緩解了阿爾茨海默病病理特征。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R749.16
【圖文】：

圖 1.1 APP 轉(zhuǎn)基因小鼠 PCR 產(chǎn)物電泳圖據(jù)統(tǒng)計(jì)處理及 OTU 聚類結(jié)果 1.2 可以直觀的看到每個(gè)樣品 Tags 數(shù)目及 OTU 數(shù)目，我們 兩組樣品的平均 Effective Tags 數(shù)分別是：68648、68947；579。

在 284bp 處顯示有陽性條帶，為 APP 轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。圖 1.1 APP 轉(zhuǎn)基因小鼠 PCR 產(chǎn)物電泳圖1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理及 OTU 聚類結(jié)果從圖 1.2 可以直觀的看到每個(gè)樣品 Tags 數(shù)目及 OTU 數(shù)目，我們可以計(jì)算出WT、AD 兩組樣品的平均 Effective Tags 數(shù)分別是：68648、68947； OTU 數(shù)目是：602、579。圖 1.2 各樣品的 OTUs 聚類和注釋情況統(tǒng)計(jì)說明：橫坐標(biāo)是樣品名；第一縱坐標(biāo)(Tags Number)是 Tags 數(shù)目；第二縱坐標(biāo)(OTUs Number)是 OTUs 的數(shù)目。

9圖 1.3 各分類水平（Phylum、Class、Order、Family、Genus、Species）上最大豐度前 10 的物種 （A、B、C、D、E、F 分別是對應(yīng) Phylum、Class、Order、Family、Genpecies）.2.4 Alpha 多樣性分析Alpha 多樣性反映了各組腸道中的物種豐富度以及差異性。指數(shù)越高，物樣性越高；數(shù)值越大，物種越多。WT 組、AD 兩組可檢測到的物種數(shù)為 4632，WT 組的各種 Alpha 多樣性指數(shù)比 AD 組大，即 WT 組內(nèi)物種多樣性好D 組。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Agata Mulak;Bruno Bonaz;;Brain-gut-microbiota axis in Parkinson's disease[J];World Journal of Gastroenterology;2015年37期

2 Wei-Lin Wang;Shao-Yan Xu;Zhi-Gang Ren;Liang Tao;Jian-Wen Jiang;Shu-Sen Zheng;;Application of metagenomics in the human gut microbiome[J];World Journal of Gastroenterology;2015年03期

本文編號：2751321