發(fā)布時(shí)間：2020-07-07 20:02

【摘要】：研究背景:近年來,隨著世界人口老齡化趨勢(shì)的日益加速,阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)已經(jīng)成為了全球性的、不容忽視的公共健康問題。資料顯示,在中國人口的社會(huì)老齡化進(jìn)程日益提速的背景下,阿茨海默病患病率呈明顯上升趨勢(shì),預(yù)計(jì)到2050年,我國老年癡呆癥患者人數(shù)將達(dá)到2700萬。如何通過防治阿爾茨海默病來提高老年人晚年生活質(zhì)量,減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)成為科學(xué)研究的焦點(diǎn)問題。因此,探究阿爾茨海默病相關(guān)的細(xì)胞及分子機(jī)制、尋找有效的早期診斷、預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對(duì)診斷阿爾茨海默病及判斷預(yù)后具有十分重要的作用。富含丙氨酸的豆蔻�；鞍准っ窩的作用底物(myristoylated alanine-rich C kinase substrate,MARCKS)屬于蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的一種特異性底物,在神經(jīng)系統(tǒng)中高水平表達(dá)。它在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分泌、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和神經(jīng)發(fā)育中起著重要作用。MARCKS蛋白以磷酸化和非磷酸化兩種不同的形式存在于大腦組織內(nèi),在G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)途徑中發(fā)揮著不可替代的作用。磷酸化后的MARCKS(Phosphorylated myristoylated alanine-rich C kinase substrate,P-MARCKS)易位到細(xì)胞質(zhì)中參與膜運(yùn)輸,細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)遞質(zhì)釋放等神經(jīng)功能活動(dòng),它定位于AD特征性病理改變-老年斑(senileplaques,SP),可能參與其誘導(dǎo)的神經(jīng)功能障礙。有研究報(bào)道,MARCKS磷酸化可以導(dǎo)致樹突棘的形態(tài)、數(shù)量、密度等發(fā)生改變,是觸發(fā)突觸病理狀態(tài)的起始事件,遠(yuǎn)早于臨床癥狀出現(xiàn)。P-MARCKS被發(fā)現(xiàn)與突觸可塑性密切相關(guān)使我們推斷P-MARCKS可能也與阿爾茨海默病相關(guān),但有關(guān)于P-MARCKS對(duì)阿爾茨海默病作用的分子機(jī)制尚不明了。以上種種證據(jù)說明MARCKS磷酸化是阿爾茨海默病發(fā)病過程中起到非常重要的作用。因此,本課題計(jì)劃通過Aβ1-42寡聚體干預(yù)乳鼠大腦皮層、海馬神經(jīng)細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型,研究Aβ1-42寡聚體的神經(jīng)毒性作用,并進(jìn)一步探索P-MARCKS在AD模型中的表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路,以及其對(duì)突觸可塑性的影響和潛在的作用機(jī)制,闡明P-MARCKS對(duì)阿爾茨海默病病變的作用,為進(jìn)一步闡明阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制提供新的思路,為臨床治療嘗試新的可能方向。方法:1.本實(shí)驗(yàn)選用Wsitar大鼠新生24h內(nèi)的乳鼠,進(jìn)行大腦皮層、海馬神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法。以常見的Aβ1-42寡聚體干預(yù)大腦皮層、海馬神經(jīng)細(xì)胞為AD細(xì)胞模型。2.用CCK-8和HOECHST33258檢測(cè)Aβ1-42寡聚體干預(yù)對(duì)細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡的影響,并應(yīng)用NMDAR拮抗劑美金剛預(yù)處理驗(yàn)證這種神經(jīng)毒性是否由NMDAR介導(dǎo)。3.用Western Blot檢測(cè)Aβ1-42寡聚體干預(yù)對(duì)P-MARCKS蛋白表達(dá)的影響,并應(yīng)用NMDAR拮抗劑美金剛預(yù)處理驗(yàn)證該蛋白表達(dá)變化是否由NMDAR介導(dǎo)。4.用Western Blot檢測(cè)Aβ1-42寡聚體干預(yù)對(duì)突觸可塑性關(guān)鍵蛋白PIP2、SYP表達(dá)的影響,并應(yīng)用NMDAR拮抗劑美金剛預(yù)處理驗(yàn)證上述蛋白表達(dá)改變是否由NMDAR介導(dǎo)。結(jié)果:1.CCK8結(jié)果顯示:各組細(xì)胞干預(yù)24h后,Aβ1-42處理組的細(xì)胞活性與對(duì)照組相比降低(P0.05,圖1)。美金剛預(yù)處理2h后再行Aβ1-42寡聚體干預(yù),細(xì)胞活性與單獨(dú)Aβ1-42處理組相比升高(P0.05,圖1)。2.各組細(xì)胞分別干預(yù)3h、24h后進(jìn)行Hoechst33258染色。單獨(dú)Aβ1-42寡聚體作用神經(jīng)元細(xì)胞3h后,少量細(xì)胞細(xì)胞核呈凋亡改變(圖2A),與對(duì)照組相比,凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例增加(P0.05,圖2C);美金剛預(yù)處理2h后再行Aβ1-42寡聚體干預(yù),凋亡細(xì)胞數(shù)減少,凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例與Aβ1-42處理組相比降低(P0.05,圖2C)。單獨(dú)Aβ1-42寡聚體作用神經(jīng)元細(xì)胞24h后,大量細(xì)胞細(xì)胞核呈現(xiàn)典型的凋亡改變(圖2B),與對(duì)照組相比,凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例增加(P0.05,圖2C);美金剛預(yù)處理2h后再行Aβ1-42寡聚體干預(yù),與對(duì)照組相比凋亡細(xì)胞數(shù)減少,凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例減少(P0.05,圖2C)。3.單獨(dú)Aβ1-42寡聚體分別作用神經(jīng)元細(xì)胞3h、24h后,P-MARCKS蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組相比增加(P0.05,圖3);美金剛預(yù)處理2h后再行Aβ1-42寡聚體干預(yù)與單獨(dú)Aβ1-42干預(yù)相比降低了P-MARCKS蛋白表達(dá)(P0.05,圖3)。4.各組細(xì)胞干預(yù)24h后,單獨(dú)Aβ1-42寡聚體作用神經(jīng)元細(xì)胞24h后,PIP2蛋白表達(dá)增加,SYP蛋白表達(dá)降低,差異與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PIP2：P0.05;SYP：P0.05,圖4);美金剛預(yù)處理2h后再行Aβ1-42寡聚體干預(yù),PIP2蛋白表達(dá)下降,SYP蛋白表達(dá)升高,差異與單獨(dú)Aβ1-42干預(yù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PIP2:P0.05;SYP：P0.05,圖4)。結(jié)論:1.Aβ1-42寡聚體可引起原代神經(jīng)細(xì)胞活力減退,NMDAR拮抗劑美金剛預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞活性下降趨勢(shì),證明Aβ1-42寡聚體的神經(jīng)毒性作用在一定程度上是由NMDAR介導(dǎo)的。2.Aβ1-42寡聚體可誘導(dǎo)原代神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡改變,NMDAR拮抗劑美金剛預(yù)處理可降低細(xì)胞凋亡率,證明Aβ1-42寡聚體的神經(jīng)毒性作用在一定程度上是由NMDAR介導(dǎo)的。3.Aβ1-42寡聚體可導(dǎo)致原代神經(jīng)細(xì)胞P-MARCKS表達(dá)增加,NMDAR拮抗劑美金剛預(yù)處理可緩解該蛋白表達(dá)變化,證明P-MARCKS蛋白表達(dá)及相關(guān)功能在一定程度上是由NMDAR介導(dǎo)的。4.Aβ1-42寡聚體可導(dǎo)致原代神經(jīng)細(xì)胞PIP2表達(dá)增加、SYP表達(dá)下降,NMDAR拮抗劑美金剛預(yù)處理可緩解上述蛋白表達(dá)變化,證明Aβ1-42寡聚體所致的突觸可塑性改變?cè)谝欢ǔ潭壬鲜怯蒒MDAR介導(dǎo)的。研究意義上述結(jié)果建議P-MARCKS在阿爾茨海默病發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,NMDAR拮抗劑美金剛可緩解Aβ1-42寡聚體介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用并通過抑制P-MARCKS表達(dá)、改變其下游PIP2和SYP表達(dá)來緩解Aβ1-42寡聚體導(dǎo)致的突觸可塑性下降。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R749.16
【圖文】：

ＣＫ－８檢測(cè)各組原代神經(jīng)元細(xì)胞活性。逡逑抑制ＡＰ「４２寡聚體所致神經(jīng)元細(xì)胞活力減退。（Ｃｏｎ組：對(duì)照組；Ａｐ組：逡逑處理組；Ｍｅ＋Ａ｜３組：美金剛及ＡｐＭ２處理組；Ｍｅ組：?jiǎn)为?dú)美金剛處理組）逡逑．０５邋ｗ邋Ｃｏｎ邋組；＃Ｐ邋＜邋０．０５邋ｗ邋ＡＰ邋組。逡逑

圖２．邋ＨＯＥＣＨＳＴ３３２５８檢測(cè)各組原代神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況。逡逑金剛可減輕ＡｐＭ２寡聚體所致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。紅色箭頭所指為凋亡。（Ｃｏｎ組：對(duì)照組；Ａｐ組：ＡｐＭ２＃理組；Ｍｅ＋Ａｐ組：美金剛及組；Ｍｅ組：?jiǎn)为?dú)美金剛處理組）逡逑（Ａ）邐３ｈ各組細(xì)胞凋亡情況逡逑（Ｂ）邐２４ｈ各組細(xì)胞凋亡情況逡逑（Ｃ邋）邋３、２４ｈ邋各組細(xì)胞凋亡率邋＞邋＜邋０．０５邋ｗ邋Ｃｏｎ邋組，＃Ｐ邋＜邋０？邋０５邋ｗ邋ＡＰ邋組逡逑６逡逑

Ｂ逡逑１．0１邋＊邋？逡逑ｇ邐娭邐一ｊｐ＂￣邐ａ邋Ｃｏｎ逡逑Ｉ邋０－８－邋■邐■邐■邋＾逡逑＿ｒ逡逑３ｈ邐２４ｈ逡逑ｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測(cè)各組原代神經(jīng)元Ｐ－ＭＡＲＣＫＳ蛋白表達(dá)情況。逡逑抑制ＡｐＭ２寡聚體致神經(jīng)元細(xì)胞Ｐ－ＭＡＲＣＫＳ表達(dá)增加。（Ｃｏｎ：ＡｐＭ２處理組；Ｍｅ＋Ａｐ組：美金剛及ＡｐＭ２處理組；Ｍｅ組：）逡逑ｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ檢測(cè)３ｈ及２４ｈ原代神經(jīng)元各組目的蛋白條帶。逡逑ＩｍａｇｅＪ軟件量化Ｐ－ＭＡＲＣＫＳ蛋白表達(dá)，并用Ｔ－ＭＡＲＣＫＳ達(dá)程度。＞＜0．0５邋ｗ邋Ｃｏｎ組，＃Ｐ＜邋０．０５邋ｗＡＰ組逡逑ＡＢ

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