【摘要】：研究背景:近年來,隨著世界人口老齡化趨勢的日益加速,阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)已經(jīng)成為了全球性的、不容忽視的公共健康問題。資料顯示,在中國人口的社會老齡化進程日益提速的背景下,阿茨海默病患病率呈明顯上升趨勢,預計到2050年,我國老年癡呆癥患者人數(shù)將達到2700萬。如何通過防治阿爾茨海默病來提高老年人晚年生活質(zhì)量,減輕社會負擔成為科學研究的焦點問題。因此,探究阿爾茨海默病相關(guān)的細胞及分子機制、尋找有效的早期診斷、預后標志物和治療靶點對診斷阿爾茨海默病及判斷預后具有十分重要的作用。富含丙氨酸的豆蔻�；鞍准っ窩的作用底物(myristoylated alanine-rich C kinase substrate,MARCKS)屬于蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的一種特異性底物,在神經(jīng)系統(tǒng)中高水平表達。它在細胞形態(tài)、細胞運動、分泌、跨膜轉(zhuǎn)運、細胞周期調(diào)節(jié)和神經(jīng)發(fā)育中起著重要作用。MARCKS蛋白以磷酸化和非磷酸化兩種不同的形式存在于大腦組織內(nèi),在G蛋白偶聯(lián)受體信號途徑中發(fā)揮著不可替代的作用。磷酸化后的MARCKS(Phosphorylated myristoylated alanine-rich C kinase substrate,P-MARCKS)易位到細胞質(zhì)中參與膜運輸,細胞運動和神經(jīng)遞質(zhì)釋放等神經(jīng)功能活動,它定位于AD特征性病理改變-老年斑(senileplaques,SP),可能參與其誘導的神經(jīng)功能障礙。有研究報道,MARCKS磷酸化可以導致樹突棘的形態(tài)、數(shù)量、密度等發(fā)生改變,是觸發(fā)突觸病理狀態(tài)的起始事件,遠早于臨床癥狀出現(xiàn)。P-MARCKS被發(fā)現(xiàn)與突觸可塑性密切相關(guān)使我們推斷P-MARCKS可能也與阿爾茨海默病相關(guān),但有關(guān)于P-MARCKS對阿爾茨海默病作用的分子機制尚不明了。以上種種證據(jù)說明MARCKS磷酸化是阿爾茨海默病發(fā)病過程中起到非常重要的作用。因此,本課題計劃通過Aβ1-42寡聚體干預乳鼠大腦皮層、海馬神經(jīng)細胞建立AD細胞模型,研究Aβ1-42寡聚體的神經(jīng)毒性作用,并進一步探索P-MARCKS在AD模型中的表達及相關(guān)信號通路,以及其對突觸可塑性的影響和潛在的作用機制,闡明P-MARCKS對阿爾茨海默病病變的作用,為進一步闡明阿爾茨海默病發(fā)病機制提供新的思路,為臨床治療嘗試新的可能方向。方法:1.本實驗選用Wsitar大鼠新生24h內(nèi)的乳鼠,進行大腦皮層、海馬神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)的方法。以常見的Aβ1-42寡聚體干預大腦皮層、海馬神經(jīng)細胞為AD細胞模型。2.用CCK-8和HOECHST33258檢測Aβ1-42寡聚體干預對細胞活性及細胞凋亡的影響,并應用NMDAR拮抗劑美金剛預處理驗證這種神經(jīng)毒性是否由NMDAR介導。3.用Western Blot檢測Aβ1-42寡聚體干預對P-MARCKS蛋白表達的影響,并應用NMDAR拮抗劑美金剛預處理驗證該蛋白表達變化是否由NMDAR介導。4.用Western Blot檢測Aβ1-42寡聚體干預對突觸可塑性關(guān)鍵蛋白PIP2、SYP表達的影響,并應用NMDAR拮抗劑美金剛預處理驗證上述蛋白表達改變是否由NMDAR介導。結(jié)果:1.CCK8結(jié)果顯示:各組細胞干預24h后,Aβ1-42處理組的細胞活性與對照組相比降低(P0.05,圖1)。美金剛預處理2h后再行Aβ1-42寡聚體干預,細胞活性與單獨Aβ1-42處理組相比升高(P0.05,圖1)。2.各組細胞分別干預3h、24h后進行Hoechst33258染色。單獨Aβ1-42寡聚體作用神經(jīng)元細胞3h后,少量細胞細胞核呈凋亡改變(圖2A),與對照組相比,凋亡細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例增加(P0.05,圖2C);美金剛預處理2h后再行Aβ1-42寡聚體干預,凋亡細胞數(shù)減少,凋亡細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例與Aβ1-42處理組相比降低(P0.05,圖2C)。單獨Aβ1-42寡聚體作用神經(jīng)元細胞24h后,大量細胞細胞核呈現(xiàn)典型的凋亡改變(圖2B),與對照組相比,凋亡細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例增加(P0.05,圖2C);美金剛預處理2h后再行Aβ1-42寡聚體干預,與對照組相比凋亡細胞數(shù)減少,凋亡細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例減少(P0.05,圖2C)。3.單獨Aβ1-42寡聚體分別作用神經(jīng)元細胞3h、24h后,P-MARCKS蛋白表達與正常對照組相比增加(P0.05,圖3);美金剛預處理2h后再行Aβ1-42寡聚體干預與單獨Aβ1-42干預相比降低了P-MARCKS蛋白表達(P0.05,圖3)。4.各組細胞干預24h后,單獨Aβ1-42寡聚體作用神經(jīng)元細胞24h后,PIP2蛋白表達增加,SYP蛋白表達降低,差異與對照組相比有統(tǒng)計學意義(PIP2：P0.05;SYP：P0.05,圖4);美金剛預處理2h后再行Aβ1-42寡聚體干預,PIP2蛋白表達下降,SYP蛋白表達升高,差異與單獨Aβ1-42干預組相比有統(tǒng)計學意義(PIP2:P0.05;SYP：P0.05,圖4)。結(jié)論:1.Aβ1-42寡聚體可引起原代神經(jīng)細胞活力減退,NMDAR拮抗劑美金剛預處理可逆轉(zhuǎn)細胞活性下降趨勢,證明Aβ1-42寡聚體的神經(jīng)毒性作用在一定程度上是由NMDAR介導的。2.Aβ1-42寡聚體可誘導原代神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡改變,NMDAR拮抗劑美金剛預處理可降低細胞凋亡率,證明Aβ1-42寡聚體的神經(jīng)毒性作用在一定程度上是由NMDAR介導的。3.Aβ1-42寡聚體可導致原代神經(jīng)細胞P-MARCKS表達增加,NMDAR拮抗劑美金剛預處理可緩解該蛋白表達變化,證明P-MARCKS蛋白表達及相關(guān)功能在一定程度上是由NMDAR介導的。4.Aβ1-42寡聚體可導致原代神經(jīng)細胞PIP2表達增加、SYP表達下降,NMDAR拮抗劑美金剛預處理可緩解上述蛋白表達變化,證明Aβ1-42寡聚體所致的突觸可塑性改變在一定程度上是由NMDAR介導的。研究意義上述結(jié)果建議P-MARCKS在阿爾茨海默病發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,NMDAR拮抗劑美金剛可緩解Aβ1-42寡聚體介導的神經(jīng)毒性作用并通過抑制P-MARCKS表達、改變其下游PIP2和SYP表達來緩解Aβ1-42寡聚體導致的突觸可塑性下降。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R749.16
【圖文】：

ＣＫ－８檢測各組原代神經(jīng)元細胞活性。逡逑抑制ＡＰ「４２寡聚體所致神經(jīng)元細胞活力減退。（Ｃｏｎ組：對照組；Ａｐ組：逡逑處理組；Ｍｅ＋Ａ｜３組：美金剛及ＡｐＭ２處理組；Ｍｅ組：單獨美金剛處理組）逡逑．０５邋ｗ邋Ｃｏｎ邋組；＃Ｐ邋＜邋０．０５邋ｗ邋ＡＰ邋組。逡逑

圖２．邋ＨＯＥＣＨＳＴ３３２５８檢測各組原代神經(jīng)元細胞凋亡情況。逡逑金剛可減輕ＡｐＭ２寡聚體所致神經(jīng)元細胞凋亡。紅色箭頭所指為凋亡。（Ｃｏｎ組：對照組；Ａｐ組：ＡｐＭ２＃理組；Ｍｅ＋Ａｐ組：美金剛及組；Ｍｅ組：單獨美金剛處理組）逡逑（Ａ）邐３ｈ各組細胞凋亡情況逡逑（Ｂ）邐２４ｈ各組細胞凋亡情況逡逑（Ｃ邋）邋３、２４ｈ邋各組細胞凋亡率邋＞邋＜邋０．０５邋ｗ邋Ｃｏｎ邋組，＃Ｐ邋＜邋０？邋０５邋ｗ邋ＡＰ邋組逡逑６逡逑

Ｂ逡逑１．0１邋＊邋？逡逑ｇ邐娭邐一ｊｐ＂￣邐ａ邋Ｃｏｎ逡逑Ｉ邋０－８－邋■邐■邐■邋＾逡逑＿ｒ逡逑３ｈ邐２４ｈ逡逑ｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測各組原代神經(jīng)元Ｐ－ＭＡＲＣＫＳ蛋白表達情況。逡逑抑制ＡｐＭ２寡聚體致神經(jīng)元細胞Ｐ－ＭＡＲＣＫＳ表達增加。（Ｃｏｎ：ＡｐＭ２處理組；Ｍｅ＋Ａｐ組：美金剛及ＡｐＭ２處理組；Ｍｅ組：）逡逑ｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ檢測３ｈ及２４ｈ原代神經(jīng)元各組目的蛋白條帶。逡逑ＩｍａｇｅＪ軟件量化Ｐ－ＭＡＲＣＫＳ蛋白表達，并用Ｔ－ＭＡＲＣＫＳ達程度。＞＜0．0５邋ｗ邋Ｃｏｎ組，＃Ｐ＜邋０．０５邋ｗＡＰ組逡逑ＡＢ

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本文編號：2745545