阿爾茨海默病患者血清中外泌體的提取鑒定及蛋白質(zhì)組學(xué)研究

發(fā)布時(shí)間：2020-07-04 05:20

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以進(jìn)行性記憶力減退、認(rèn)知功能下降和人格改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,是老年期癡呆中最常見的一種類型,其病理特征為大腦皮層和海馬出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)聚集形成的老年斑、Tau蛋白聚集形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)以及神經(jīng)細(xì)胞大量減少丟失。AD病理改變發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是Aβ沉積,在AD發(fā)病及病理進(jìn)展中具有十分重要的作用。我國是目前世界上唯一一個(gè)老年人口超過1億的國家,因此AD患病人數(shù)迅速增長,是老齡化社會(huì)面臨的最重要衛(wèi)生健康問題,亟需提高癡呆的識(shí)別率和早期診斷率。目前所使用的阿爾茨海默病診斷標(biāo)準(zhǔn)基本上都是以臨床表現(xiàn)為基礎(chǔ),再結(jié)合相關(guān)病史、精神狀態(tài)、認(rèn)知及心理學(xué)測試結(jié)果,并排除其他可能導(dǎo)致癡呆綜合征的疾病。2011年發(fā)表的AD診斷標(biāo)準(zhǔn)(NIA-AA)納入了生物標(biāo)志物,即功能影像學(xué)顯示特殊腦皮層區(qū)葡萄糖代謝率下降或Aβ42降低或/和tau蛋白升高,然而由于受到資源和操作程序等因素的限制,生物標(biāo)志物不能廣泛運(yùn)用于AD的診斷性篩查。并且在AD臨床癥狀出現(xiàn)之前,AD的病理改變已經(jīng)發(fā)生了多年。因此,AD的臨床診斷遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于AD的發(fā)生發(fā)展,以致于無法做到真正意義上的早期診斷和防治。外泌體(exosomes)是一種直徑約為40~150nm的圓形或橢圓形單層囊泡結(jié)構(gòu),可由機(jī)體許多類型的細(xì)胞釋放。外泌體能在體液中穩(wěn)定存在,而同時(shí)由于其體積小可避免被單核巨噬細(xì)胞吞噬,且能自由地透過血管壁及細(xì)胞外基質(zhì),因此可在血液、乳液、尿液、唾液等體液中廣泛存在,最終可實(shí)現(xiàn)與周圍細(xì)胞的膜融合及生物膜的循環(huán)。外泌體能夠運(yùn)載各種生物活性分子,且種類繁多,包括了蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸成分等,能夠從多途徑、多位點(diǎn)上對受體細(xì)胞的信息進(jìn)行調(diào)節(jié),從而有效地提高了調(diào)節(jié)的程度以及精細(xì)度,更加符合機(jī)體的需要。但外泌體的這種交流能力并非都會(huì)產(chǎn)生有利的結(jié)果,有時(shí)這些變性蛋白或者致病性蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)將會(huì)進(jìn)一步加重神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展,比如有體外實(shí)驗(yàn)證明外泌體能夠通過細(xì)胞間運(yùn)輸與帕金森病相關(guān)的α-突觸核蛋白。有相關(guān)研究表明,外泌體能夠釋放與AD相關(guān)的Aβ,使這些蛋白在腦內(nèi)的沉積過程進(jìn)一步加劇。外泌體包含多種蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì),被認(rèn)為是疾病的生物標(biāo)志物。近些年,外泌體的研究逐步用于臨床診斷和治療,如外泌體microRNA可作為肺癌的診斷標(biāo)志物,尿液樣本中的外泌體蛋白圖譜還能協(xié)助腎臟疾病的診斷,外泌體可通過降低AD患者β淀粉樣蛋白起治療AD作用。目的:擬分離鑒定阿爾茨海默病患者和正常老年對照者血清中外泌體,并利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對從血清中分離出來的外泌體進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的篩選研究,試圖尋找與阿爾茨海默病發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)分子,為探索阿爾茨海默病早期診斷及防治的生物靶標(biāo)提供理論依據(jù)。方法:用ExoQuick試劑盒提取阿爾茨海默病患者及正常老年對照者血清中外泌體;透射電鏡觀察其形態(tài)特征,western blot鑒定外泌體的表面標(biāo)志物CD63;BCA法對提取的外泌體進(jìn)行蛋白定量測定;對分離出的外泌體進(jìn)行雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析鑒定差異蛋白。結(jié)果:1.透射電鏡下觀察血清中外泌體均為既往文獻(xiàn)報(bào)道的典型的圓形或橢圓形囊泡結(jié)構(gòu),平均直徑在30-150nm,有完整脂質(zhì)包膜;2.Western blot驗(yàn)證結(jié)果表明外泌體特異性標(biāo)志物CD63在血清來源的外泌體中均表達(dá)陽性;3.雙向凝膠電泳篩選出差異表達(dá)3倍以上的差異蛋白點(diǎn)約26個(gè),其中阿爾茨海默病患者中相對正常對照組表達(dá)上調(diào)的有10個(gè),表達(dá)下調(diào)的有16個(gè),選取其中3個(gè)蛋白點(diǎn)做質(zhì)譜分析并鑒定蛋白名稱為:維生素D結(jié)合蛋白(Vitamin D-binding protein,VTDB),CD5抗原(CD5 antigen-like,CD5L),免疫球蛋白重鏈(Immunoglobulin heavy constant mu,IGHM)。結(jié)論:1.成功從阿爾茨海默病患者的外周血清中分離出外泌體,為深入研究外泌體蛋白與阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。2.篩選鑒定出的3個(gè)差異蛋白:維生素D結(jié)合蛋白(Vitamin D-binding protein,VTDB),CD5抗原(CD5 antigen-like,CD5L),免疫球蛋白重鏈(Immunoglobulin heavy constant mu,IGHM)可能與AD的發(fā)病相關(guān),可為尋找阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的生物標(biāo)志物提供候選蛋白。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R749.16
【圖文】：

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