【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種最常見的神經(jīng)退行性疾病,神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle, NFT)和老年斑(senile plaque)為其主要病理特征,神經(jīng)原纖維纏結(jié)的數(shù)量與病人認(rèn)知功能嚴(yán)重程度密切相關(guān)。構(gòu)成NFT的主要成分是異常過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau。Tau蛋白的主要功能是促進(jìn)微管組裝,維持微管穩(wěn)定性,維持神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的軸突運(yùn)輸。當(dāng)tau蛋白被異常過度磷酸化,并在細(xì)胞內(nèi)形成了聚積后,導(dǎo)致tau蛋白功能異常,引起微管解聚,最后促使神經(jīng)元發(fā)生退行性變。Tau蛋白的磷酸化水平受多種激酶的調(diào)節(jié),尤其是PKA和GSK-3β,在tau蛋白的磷酸化過程中起著重要作用。激酶活性上調(diào)是導(dǎo)致tau蛋白異常過度磷酸化的重要原因。已有研究報(bào)道,Tau的過度磷酸化可能是多種激酶聯(lián)合作用的結(jié)果,tau的某些位點(diǎn)被一種激酶磷酸化后,可以促進(jìn)或抑制其他激酶對(duì)tau蛋白磷酸化位點(diǎn)的磷酸化,如動(dòng)物整體和體外試驗(yàn)表明,PKA對(duì)tau蛋白某些位點(diǎn)的預(yù)磷酸化可促進(jìn)GSK-3β對(duì)tau的磷酸化作用,在GSK-3β活性不明顯增加的情況下,能促使tau蛋白過度磷酸化,其具體作用機(jī)制尚不清楚。為了探討tau的PKA磷酸化位點(diǎn)是如何影響tau蛋白生物學(xué)功能,從而闡明體內(nèi)PKA與GSK-3β共同調(diào)節(jié)tau蛋白的磷酸化的機(jī)制。我們構(gòu)建了含不同PKA磷酸化位點(diǎn)突變的tau原核與真核表達(dá)重組體,用真核載體在細(xì)胞水平,探討tau蛋白PKA磷酸化位點(diǎn)預(yù)磷酸化如何改變tau的底物特性、聚積性質(zhì)和生物學(xué)功能等。 本實(shí)驗(yàn)分別在HEK293/wt細(xì)胞和N2a/wt細(xì)胞上瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同重組tau的真核表達(dá)載體,再用PKA特異性激活劑forskolin,以及forskolin與GSK-3β特異性抑制劑SB聯(lián)合處理,以確定是GSK-3β的作用,最后分別用免疫印跡技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測tau蛋白的磷酸化狀態(tài)及其分布聚集狀態(tài)。 結(jié)果顯示:Forskolin可以通過激活PKA,使tau蛋白PKA磷酸化位點(diǎn)磷酸化但不能使其突變位點(diǎn)磷酸化;當(dāng)tau蛋白409位點(diǎn)的絲氨酸突變?yōu)楸彼釙r(shí),Ser262位點(diǎn)的磷酸化程度減弱,Ser404位點(diǎn)沒有被磷酸化;Tau蛋白409位點(diǎn)的絲氨酸突變?yōu)楣劝彼釙r(shí),Ser262位點(diǎn)的磷酸化程度增強(qiáng),而Ser404位點(diǎn)依舊沒有被磷酸化; Tau~(S214A)、tau~(S262A)、tau~(S409A)與tau~(S409E)蛋白較tau~(WT)蛋白的Thr231位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)均有不同程度的減弱;Tau~(WT)在forskolin作用下其Ser396/404(PHF-1檢測的位點(diǎn))的磷酸化程度增加了,而tauS214A、tau~(S262A)及tau~(S409A)在forskolin處理后Ser396/404位點(diǎn)的磷酸化程度均降低了,在forskolin+SB聯(lián)合作用下Ser396/404位點(diǎn)幾乎不能被磷酸化。 以上研究結(jié)果表明:1. Ser409位點(diǎn)的磷酸化可以使tauSer262位點(diǎn)更易被相應(yīng)的激酶磷酸化,并且Ser409突變使Ser404位點(diǎn)不易被磷酸化。2. tau蛋白的Ser214位點(diǎn)的磷酸化可以促進(jìn)Thr231位點(diǎn)的磷酸化;3. PKA分別預(yù)磷酸化tau蛋白的Ser262/409位點(diǎn),均可以增強(qiáng)GSK-3β對(duì)Ser396/404位點(diǎn)的磷酸化作用,使其磷酸化水平明顯增高。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R749.16

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3 傅q

本文編號(hào)：2736826