【摘要】：抑郁癥是一種嚴(yán)重危害人類身心健康的常見疾病,隨著人們生活壓力的增大及工作節(jié)奏加快,抑郁癥的發(fā)病率逐年上升,該病不僅困擾患者的生活和工作,也對其家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān),因此對于該病的治療及發(fā)病機(jī)制的研究也日益受到重視。在過去幾十年里,抑郁癥治療已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展�，F(xiàn)行的臨床常用抗抑郁藥物,主要通過靶向阻斷大腦中5-羥色胺和去甲腎上腺素高親和性轉(zhuǎn)運(yùn)體對單胺神經(jīng)遞質(zhì)的重?cái)z取,發(fā)揮藥理功能。然而,仍有相當(dāng)大比例的患者未能獲得良好的治療效果。因此,社會(huì)人群亟待起效快、收效明顯和耐受性好的新型抗抑郁藥物或者治療方案。 近期研究中,有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2(OCT2, SLC22A2)作為高親和性轉(zhuǎn)運(yùn)體的一個(gè)補(bǔ)充體系而受到關(guān)注。OCT2對單胺神經(jīng)遞質(zhì)雖然親和力低但攝取容量大,是后突觸上胺能神經(jīng)緊張的重要決定因素之一,能調(diào)節(jié)與情緒相關(guān)的一系列行為。為了評價(jià)抑制OCT2能否有助于抗抑郁藥物藥理活性發(fā)揮,我們首先構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人源性O(shè)CT2的細(xì)胞模型,并從mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)和攝取功能3個(gè)水平驗(yàn)證細(xì)胞模型的可靠性。攝取功能考察中,先以熒光底物ASP+初步篩選,再用OCT2經(jīng)典底物二甲雙胍和MPP+進(jìn)一步確證。 選擇mRNA和蛋白水平驗(yàn)證陽性且攝取功能最強(qiáng)的細(xì)胞模型,擴(kuò)大培養(yǎng),當(dāng)作實(shí)驗(yàn)對象。抑制實(shí)驗(yàn)受試的前線抗抑郁藥物,包括選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑(氟西汀、舍曲林和帕羅西汀)、三環(huán)類抗抑郁藥(阿米替林、丙咪嗪和地昔帕明)、單胺氧化酶抑制劑(嗎氯貝胺)和5-羥色胺和去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑(文拉法辛)。上述經(jīng)典抗抑郁藥對OCT2介導(dǎo)的二甲雙胍、5-羥色胺和去甲腎上腺素有抑制作用,但在生理濃度下抑制程度微弱,反面提示OCT2在抗抑郁治療中的重要地位。SSRIs(對二甲雙胍和5-羥色胺的IC5o范圍1-10μM)和TCAs(對二甲雙胍和去甲腎上腺素的IC50范圍約為100nM-1μM)比較強(qiáng),嗎氯貝胺(對二甲雙胍和5-羥色胺的IC50范圍10-100μM,對去甲腎上腺素大于100μM)次之,文拉法辛(對三種底物的IC50均大于100μM)相對最弱。其中,舍曲林和地昔帕明雖然競爭性抑制OCT2活性,但由于在進(jìn)細(xì)胞過程中,被動(dòng)擴(kuò)散的效果大于轉(zhuǎn)運(yùn)而不易被察覺。所以,抑制OCT2在抗抑郁藥物藥理活性中不容小覷,盡管在臨床實(shí)際操作中對總體治療效果仍需考查。 我們從一系列報(bào)道的抗抑郁樣中藥單體中,篩選出胡椒堿、小檗堿和藥根堿這三種OCT2抑制劑。考查這三種生物堿對OCT2和OCT3介導(dǎo)的二甲雙胍、5-羥色胺和去甲腎上腺素?cái)z取能力的影響,發(fā)現(xiàn)生物堿的抑制效果顯著。接著,制備鼠源突觸小體,考查以O(shè)CT為代表的uptake2體系相對于以高親和性轉(zhuǎn)運(yùn)體為代表的uptake1體系對抗抑郁機(jī)制的貢獻(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果,肯定了OCT機(jī)制的重要性。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.4
【圖文】：

- ‘逆b/圖2.1瓊脂糖凝膠電泳鑒定卩\1019-丁-110(：丁2質(zhì)粒。圖2.1八為環(huán)形質(zhì)粒的完整狀態(tài)；圖2.1 B為質(zhì)粒BamHI/XhoI雙酶切后。采用Marker III指征質(zhì)粒大小，平行兩份上樣。2.3.2. hOCT2A27os突變體基因的構(gòu)建定點(diǎn)突變后，用Dpnl酶，37 °C,消化Ih,除去摸板質(zhì)粒，將突變產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH 5a感受態(tài)細(xì)胞，次日挑單菌落搖菌，提質(zhì)粒（見圖2.2 A),雙酶切鑒定（見圖2.2 B),得到長度為2.7 kb，1.7 kb的兩個(gè)片斷，分別對應(yīng)載體和目的基因的大小

2000 2000圖2.2瓊脂糖凝膠電泳鑒定pMD19-T-hOCT2A2TOS質(zhì)粒。圖2.2 A為環(huán)形質(zhì)粒的完整狀態(tài)；圖2.2 B為質(zhì)粒BamH I/Xlio I雙酶切后。采用Marker III指征質(zhì)粒大小，平行兩份上樣。2.3.3.真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-hOCT2 和 hOCT2A270s 的構(gòu)建將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH 5a感受態(tài)細(xì)菌。轉(zhuǎn)化次日，挑取單菌落，搖菌，抽提質(zhì)粒，電泳鑒定（見圖2.3 A和2.4 A)，雙賄切鑒定（見圖2.3 B和2.4 B)，均得到約為5.4 kb的pcDNA3.1(+)載體片度和約為1.7 kb的目的基因片段，初步鑒定質(zhì)粒正確。將鑒定正確的質(zhì)粒測序，測序結(jié)果表明pcDNA3.1(+;)-hOCT2和hOCT2A270s質(zhì)粒構(gòu)建成功。28

本文編號：2733441