【摘要】：中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和再生一直是神經(jīng)科學界備受關注的研究領域,傳統(tǒng)觀念認為成年哺乳類動物腦組織的神經(jīng)元是終級細胞,一旦遭受破壞將不能再生。然而,近年來發(fā)現(xiàn)哺乳類動物腦內海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)和側腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)的神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)能夠分化為神經(jīng)細胞—神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)。因此,新生神經(jīng)元被認為能取代自然老化或者病變的神經(jīng)元,最大限度地維護腦的功能和結構。阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以進行性認知功能障礙為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD的主要病理特征為:細胞外老年斑過度沉積,細胞內形成神經(jīng)纖維纏結及神經(jīng)元變性、缺失等。新生神經(jīng)元是否能替代病變的神經(jīng)元—神經(jīng)再生(neuroregeneration),改善認知功能障礙已成為目前AD研究的一個新焦點。神經(jīng)再生過程主要包括神經(jīng)干細胞增殖,分化和成熟等。在AD腦和APP/PS1轉基因小鼠中,海馬神經(jīng)元前體細胞向神經(jīng)元分化比例明顯減少,新生神經(jīng)元的存活率與Aβ產(chǎn)生和沉積的嚴重程度呈負相關,同時新生神經(jīng)元的突起生長異常,提示神經(jīng)再生障礙是導致AD認知功能進行性減退的重要病理機制之一。細胞周期阻滯及增殖相關信號通路的改變是細胞增殖抑制的兩個主要機制。Aβ聚集使其具有神經(jīng)細胞毒性,破壞細胞膜完整性引起細胞內DNA斷裂,導致細胞周期異常。在AD患者海馬組織cAMP水平下降,環(huán)磷酸腺苷反應序列結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)磷酸化水平下降,證實了CREB與AD的形成有密切關系。神經(jīng)甾體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中各種甾體及其代謝產(chǎn)物的總稱。孕酮(progesterone,PROG)是一種重要的內源性神經(jīng)甾體,除了在生殖和內分泌系統(tǒng)發(fā)揮作用,還可影響神經(jīng)系統(tǒng)功能包括促進神經(jīng)細胞存活,抑制細胞凋亡,抑制炎癥反應等。研究發(fā)現(xiàn)孕酮可促進PI3K/AKt信號通路激活,調節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurophic factor,BDNF)的合成與釋放。但是關于孕酮發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制尚未全完闡明。一方面,孕酮可與其經(jīng)典核受體結合,通過經(jīng)典基因途徑發(fā)揮調節(jié)作用;另一方面,可與細胞膜上GABA_A受體、NMDA受體、PGRMC1/2受體等結合,通過非基因途徑發(fā)揮快速調節(jié)作用。越來越多的證據(jù)表明孕酮可通過非經(jīng)典受體機制發(fā)揮作用,其中研究最多的是孕酮膜結合蛋白1(progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1),其可能是孕酮發(fā)揮神經(jīng)保護作用的重要靶點之一。本實驗采用Aβ活性片斷Aβ_(25-35)作用于原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)干細胞建立AD細胞模型,以APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠作為AD動物模型,分別研究了孕酮在細胞和動物水平對神經(jīng)再生的影響及相關機制,為孕酮能用于AD的防治提供理論依據(jù)。第一部分孕酮對AD細胞模型神經(jīng)再生的影響目的:研究孕酮對AD細胞模型神經(jīng)干細胞存活,增殖,凋亡及分化的影響。方法:取新生SD大鼠海馬組織進行體外分離培養(yǎng)及誘導分化,Immofluorescence方法檢測神經(jīng)干細胞標志物Nestin、誘導分化后成熟神經(jīng)元標志物βⅢ-Tubulin及星形膠質細胞標志物GFAP的表達情況;采用Aβ_(25-35)處理大鼠海馬神經(jīng)干細胞,建立AD細胞模型,應用CCK-8、Brdu摻入法(Brdu Elisa)、Western blot、Immofluorescence、流式細胞術等檢測方法系統(tǒng)性的研究孕酮對Aβ_(25-35)誘導的神經(jīng)干細胞存活、增殖、凋亡及分化的影響。結果:1.大鼠海馬神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)、誘導分化及鑒定神經(jīng)干細胞純度90%,可誘導分化為神經(jīng)元及星形膠質細胞。2.孕酮對AD細胞模型神經(jīng)干細胞存活、增殖及凋亡的影響CCK-8結果顯示,與對照組相比,20μM Aβ_(25-35)作用48后,大鼠海馬神經(jīng)干細胞明顯損傷,細胞存活率為對照組的(59.3±6.4)%(P0.01);與Aβ組比較,孕酮能濃度和時間依賴地促進Aβ誘導的NSCs存活。在0.01-10μM范圍內,1μM孕酮對Aβ處理神經(jīng)干細胞48h,促進存活率作用最顯著,其存活率為對照組的(89.6±4.7)%(P0.01)。Immofluorescence結果顯示,Brdu陽性標記位于增殖期細胞核內,定位準確。與對照組相比,Aβ?lián)p傷組Brdu陽性增殖細胞顯著減少(P0.01)。與Aβ組相比,孕酮保護組Brdu陽性細胞顯著增多(P0.01)。與Brdu摻入法結果一致。Western blot結果顯示,Aβ誘導的模型組胞漿中cleaved-caspase 3表達水平為對照組的2.6倍,顯著高于對照組(P0.01)。與模型組相比,Aβ與PROG共孵育后cleaved-caspase 3表達水平無顯著性差異(P0.05)。3.孕酮對AD細胞模型神經(jīng)干細胞分化的影響Immofluorescence結果顯示,與對照組相比,Aβ組DCX~+陽性細胞數(shù)顯著降低,分化成神經(jīng)元前體細胞突起顯著縮短(P0.01)。與Aβ組比較,PROG保護組DCX~+陽性細胞數(shù)顯著升高,細胞突起顯著延長(P0.01)。流式細胞術結果顯示,與對照組相比,Aβ?lián)p傷組分化成βⅢ-Tubulin、GFAP陽性細胞的百分率顯著降低(P0.05)。與Aβ組比較,PROG組分化成βⅢ-Tubulin陽性細胞的百分率顯著升高(P0.01),分化成GFAP陽性細胞的百分率無顯著性差異(P0.05)。小結:1.孕酮能濃度和時間依賴地提高Aβ_(25-35)誘導AD細胞模型神經(jīng)干細胞的存活率,促進其增殖,對神經(jīng)干細胞凋亡無影響。2.孕酮促進Aβ_(25-35)誘導的神經(jīng)元前體細胞新生,促進其突起生長。同時逆轉Aβ_(25-35)抑制分化的作用,促進向神經(jīng)元分化。第二部分孕酮對AD細胞模型神經(jīng)干細胞細胞周期的影響目的:研究孕酮對AD細胞模型神經(jīng)干細胞細胞周期及其相關蛋白Cyclin D1、PCNA表達水平的影響。方法:在大鼠海馬培養(yǎng)神經(jīng)干細胞Aβ?lián)p傷所致AD細胞模型的基礎上,以神經(jīng)甾體孕酮作為干預物,應用流式細胞術檢測細胞周期的變化;應用Western blot技術,檢測細胞周期相關蛋白Cyclin D1、PCNA表達。結果:1.孕酮對AD細胞模型NSCs細胞周期的影響與對照組相比,Aβ組G0/G1期細胞顯著增多,S期細胞顯著減少,增殖指數(shù)(PI)顯著降低(P0.05)。與Aβ組相比,孕酮保護組G0/G1期細胞顯著降低,S期細胞顯著增多,PI顯著升高(P0.05)。2.孕酮對AD細胞模型中NSCs細胞周期相關蛋白Cyclin D1、PCNA表達水平的影響Western-blot檢測顯示,與對照組相比,Aβ組Cyclin D1、PCNA蛋白表達水平顯著降低(P0.05)。與Aβ組相比,孕酮保護組Cyclin D1、PCNA蛋白表達水平顯著升高(P0.05)。小結:孕酮能夠逆轉Aβ所致G0/G1期細胞阻滯,上調細胞周期相關蛋白Cyclin D1、PCNA的表達水平,促進神經(jīng)干細胞增殖。第三部分孕酮對AD細胞模型神經(jīng)干細胞AKt/CREB/BDNF信號通路的影響目的:研究神經(jīng)甾體孕酮對CREB信號通路及其上游PI3K/AKt,下游BDNF三者之間調控作用。方法:應用Western-blot、Brdu摻入法、流式細胞術分別檢測孕酮和Rolipram(p-CREB激活劑)對Aβ誘導的神經(jīng)干細胞CREB、BDNF的表達,增殖和分化的影響;應用上述方法檢測孕酮和LY294002(PI3K/AKt通路抑制劑)對Aβ誘導的神經(jīng)干細胞AKt、CREB及BDNF的表達,增殖和分化的影響。結果:1.孕酮對AD細胞模型中神經(jīng)干細胞CREB/BDNF的影響Western-blot結果顯示:與Aβ?lián)p傷組相比,PROG保護組和Rolipram處理組均能引起p-CREB(Ser133)、BDNF蛋白表達顯著升高(P0.05),各組T-CREB表達水平組間無顯著性差異(P0.05)。Brdu摻入法及流式細胞術結果顯示:與模型組比,PROG保護組和Rolipram預處理組顯著促進神經(jīng)干細胞的增殖及向神經(jīng)元分化(P0.05)。2.孕酮AD細胞模型中神經(jīng)干細胞PI3K/AKt的影響Western blot結果顯示:與Aβ?lián)p傷組相比,孕酮保護組能夠引起p-AKt(Ser473)蛋白表達顯著升高(P0.05);與PROG保護組相比,LY294002組p-AKt蛋白表達顯著降低(P0.05),各組T-AKt、T-CREB表達水平組間無顯著性差異(P0.05)。此外,各處理組神經(jīng)干細胞p-CREB、BDNF變化水平與p-AKt一致。Brdu摻入法及流式細胞術結果顯示:與模型組比,孕酮組顯著促進神經(jīng)干細胞增殖及向神經(jīng)元分化(P0.05)。與PROG保護組相比,LY294002預處理組顯著抑制NSCs的增殖及向神經(jīng)元分化(P0.05)。小結:孕酮促進PI3K/AKt-CREB信號通路的激活,上調BDNF的表達,發(fā)揮促進AD細胞模型神經(jīng)干細胞增殖與神經(jīng)元樣分化作用。第四部分孕酮促進AD細胞模型神經(jīng)再生PGRMC1作用的研究目的:研究孕酮是否通過PGRMC1介導AKt/CREB/BDNF信號通路發(fā)揮保護作用。方法:應用Immofluorescence檢測PGRMC1和classic PR在神經(jīng)干細胞的表達情況;Western blot檢測Aβ對神經(jīng)干細胞PGRMC1表達的影響;構建PGRMC1慢病毒載體,慢病毒感染NSCs篩選最佳轉染復數(shù)(MOI)及時間;PCR、Western Blot、Brdu Elisa檢測慢病毒感染神經(jīng)干細胞后PGRMC1基因和蛋白的表達情況及慢病毒對神經(jīng)干細胞增殖的影響;Western Blot、Brdu Elisa、流式細胞術檢測PGRMC1 siRNA對神經(jīng)干細胞增殖和分化及AKt、CREB、BDNF表達的影響結果:1.PGRMC1在神經(jīng)干細胞的胞體和細胞核均有表達,classic PR在神經(jīng)干細胞中無表達。2.Aβ對神經(jīng)干細胞中PGRMC1表達的影響Western blot結果顯示,Aβ處理48h后,PGRMC1表達顯著升高。與Ctr組相比,Aβ組PGRMC1的相對表達量增加了67%(P0.05)。3.慢病毒轉染NSCs篩選最佳感染復數(shù)(MOI)及時間各組神經(jīng)干細胞加入慢病毒培養(yǎng)液,于熒光顯微鏡下觀察,慢病毒感染48h,GFP綠色熒光強度隨著MOI值增加而增加,ENi.s+Poly組相比于其它組GFP綠色熒光強度顯著增強(P0.05)。當MOI值為20時,GFP綠色熒光分布均勻,大量表達。以MOI值20感染神經(jīng)干細胞,隨著時間的延長,GFP綠色熒光從微弱逐漸增強,48h后,與對照組相比,GFP綠色熒光強度顯著增強(P0.05),因此慢病毒感染神經(jīng)干細胞最佳培養(yǎng)液為ENi.s+Poly,MOI值為20,時間為48h,用于后續(xù)實驗。4.慢病毒感染神經(jīng)干細胞后PGRMC1基因及蛋白表達水平及增殖的變化NSCs正常組和Scrambled siRNA(隨機序列作為感染陰性對照)組PGRMC1基因和蛋白正常表達。與正常對照組相比,siRNA 61634基因和蛋白表達顯著降低(P0.05)。同時Brdu Elisa結果顯示,與對照組相比,各轉染組神經(jīng)干細胞增殖無顯著性差異(P0.05)。說明siRNA 61634干擾效果較好,可用于后續(xù)實驗。5.PGRMC1 siRNA對AKt/CREB/BDNF信號通路的影響Western blot結果顯示:與孕酮保護組相比,siRNA 61634處理組p-CREB蛋白表達顯著降低(P0.05),大鼠海馬神經(jīng)干細胞中p-AKt、BDNF變化水平與p-CREB一致。Brdu Elisa及流式細胞術結果顯示:與孕酮保護組相比,siRNA 61634處理組顯著抑制了神經(jīng)干細胞的增殖及向神經(jīng)元樣分化作用(P0.05)。小結:孕酮部分通過PGRMC1介導調控AKt/CREB/BDNF信號通路通路,促進神經(jīng)干細的增殖與分化。第五部分孕酮對APP/PS1轉基因小鼠神經(jīng)再生和學習記憶的影響目的:研究孕酮對APP/PS1轉基因小鼠海馬區(qū)新生神經(jīng)元存活、分化成成熟神經(jīng)元、空間學習記憶的影響及其相關機制方法:選取APP/PS1轉基因小鼠作為AD動物模型,頸部皮下注射孕酮,腹腔注射Brdu。應用Immofluorescence檢測海馬區(qū)28天齡Brdu~+、Brdu~+/NeuN~+細胞數(shù),p-AKt、p-CREB蛋白著色情況;應用BDNF Elisa試劑盒檢測血清中BDNF變化;應用Morris水迷宮檢測小鼠學習記憶行為學的改變。結果:1.孕酮對APP/PS1轉基因鼠海馬區(qū)新生神經(jīng)元存活及分化成成熟神經(jīng)元的影響Immofluorescence結果顯示:與APP/PS1轉基因小鼠組比,PROG處理可顯著增加APP/PS1小鼠28天齡-Brdu~+和Brdu~+/NeuN~+數(shù)量(P0.05)。2.孕酮對APP/PS1轉基因小鼠海馬區(qū)AKt/CREB/BDNF信號通路的影響結果顯示:APP/PS1小鼠腦區(qū)p-AKt、p-CREB蛋白著色不明顯;與APP/PS1轉基因小鼠相比,經(jīng)孕酮治療后的小鼠腦區(qū)p-AKt、p-CREB蛋白表達顯著升高(P0.05)。BDNF Elisa結果顯示:與APP/PS1轉基因小鼠相比,經(jīng)孕酮治療后的血液上清液中BDNF顯著升高(P0.01)。3.孕酮對APP/PS1轉基因小鼠學習記憶行為學的影響Morris水迷宮結果顯示:在定位航行實驗中:三組小鼠平均游速之間無統(tǒng)計學差異(P0.05),三組小鼠逃避潛伏期均隨學習天數(shù)增加而縮短。孕酮治療組小鼠逃避潛伏期較APP/PS1組顯著縮短(P0.01)�？臻g探索實驗結果顯示:與APP/PS1組相比,孕酮組小鼠穿越平臺區(qū)的次數(shù)及平臺所在象限停留時間百分比均顯著增加(P0.01)。小結:孕酮促進APP/PS1小鼠海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生,激活AKt/CREB/BDNF信號通路,進而改善APP/PS1轉基因小鼠空間學習記憶能力。結論:1.孕酮能濃度和時間依賴地提高Aβ_(25-35)誘導AD細胞模型神經(jīng)干細胞的存活率,促進NSCs增殖。且發(fā)揮促進神經(jīng)元前體細胞新生及其突觸生長,促神經(jīng)元樣分化作用。2.孕酮能夠逆轉Aβ所致的G0/G1期細胞阻滯,上調Cyclin D1、PCNA的表達;同時通過促進PI3K/AKt-CREB信號通路的激活,上調BDNF的表達水平,促進AD細胞模型中神經(jīng)干細胞的增殖與向神經(jīng)元樣分化。3.孕酮部分通過PGRMC1介導調控AKt/CREB/BDNF信號通路。4.孕酮促進APP/PS1小鼠海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生,激活AKt/CREB/BDNF信號通路,改善APP/PS1轉基因小鼠空間學習記憶能力。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R749.16
【圖文】：

圖 1-1 新生大鼠海馬神經(jīng)干細胞純度及誘導分化鑒定1 The identify in purity and differentiation of rat hippocampal neurstem cells.l stem cells stained for Nestin (red), neurons stained for βⅢ-Tubuli), astrocyte stained for GFAP (red) and DAIP was used to stain nucl(blue). Scale bar = 50 μm

34圖 1-2 孕酮促進 AD 細胞模型神經(jīng)干細胞存活率-2 Progesterone promotes the viability of NSCs in the AD cell modeogesterone increases viability of NSCs treated by Aβ inpendent manner. NSCs cultures were exposured to 20μM Aβ25 35wout different concentration of progesterone for 48h, and then assayK-8. (B) Progesterone increases viability of NSCs treated by Aβpendent manner. NSCs cultures were exposed to 20μM Aβ25 35with 1μM progesterone for the indicated times, and then assayed for c. Data are expressed as mean ±SD.△△P<0.01 compared with con1 compared with Aβ.*P<0.05 compared with Aβ.

【參考文獻】

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1 張書剛;張穎冬;;β淀粉樣蛋白致神經(jīng)細胞凋亡機制的研究進展[J];中國臨床神經(jīng)科學;2008年03期

2 李學坤,左萍萍,孔令娜,張卿;Aβ_(25-35)抑制成年小鼠海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)前體細胞增殖[J];中國藥理學通報;2004年07期

3 王亞利,宋天保,路明,許琨;Aβ誘導PC-12細胞凋亡建立阿爾茨海默病細胞模型[J];西安醫(yī)科大學學報;2002年02期

本文編號：2721579