發(fā)布時間：2020-06-14 07:49

【摘要】：研究目的:抑郁癥是一種以持續(xù)的心境低落為主要特征的神經障礙型疾病,是嚴重危害人類健康的神經、精神類疾病之一。抑郁癥的發(fā)病受心理、遺傳、生物學、社會等多重因素的影響。最近研究發(fā)現(xiàn)機體受到持續(xù)的應激刺激而誘發(fā)抑郁行為表現(xiàn)時,通常伴隨特定腦區(qū)內神經炎癥的發(fā)生,但神經炎癥反應在抑郁癥發(fā)病中的機制,目前尚不明確。因此,本課題擬構建慢性不可預知性溫和應激刺激(Chronic Unpredicted Mild Stress,CUMS)誘導的抑郁癥大鼠模型,采用行為學、分子生物學和形態(tài)學等多種實驗方法,研究海馬CA1區(qū)ββCaMKII是否通過調控COX2-PGE2信號通路參與神經炎癥反應,并探討其在抑郁癥發(fā)病中的作用和機制。研究方法:(1)將雄性Wistar大鼠(140g-160g)隨機分為空白對照組、CUMS組、COX-2抑制劑塞來昔布預處理組(Celecoxib+CUMS,20mg/kg)、抗抑郁藥氟西汀預處理組(Fluoxetine+CUMS,40mg/kg)。除空白對照組外,其余三組均給予為期5周的慢性不可預知性溫和應激刺激。每次在刺激前30分鐘給予藥物預處理組大鼠分別腹腔注射Celecoxib或Fluoxetine。建模完成后進行強迫游泳實驗和糖水偏好實驗等行為學測試。(2)Western Blot技術檢測COX-2、ββCaMKII的表達及βCaMKⅡ蛋白的磷酸化水平;ELISA技術檢測PGE2的含量變化;激光共聚焦檢測小膠質細胞和星型膠質細胞的數量及形態(tài)變化。(3)Western Blot技術檢測Nrf-2、HO-1的表達;利用試劑盒檢測SOD、CAT、T-AOC酶活性,使用MDA、NO試劑盒檢測產物含量變化,LDH試劑盒測定酶含量變化;激光共聚焦觀察DHE、4-HNE和8-OHdG的表達,以檢測ROS水平和DNA氧化損傷的變化。(4)構建過表達或敲減βCaMKⅡ的AAV腺相關病毒,靶向海馬CA1區(qū)進行立體定位注射,將大鼠分成以下幾組:(a)Wild type(WT);(b)CUMS;(c)CUMS+AAV-Control;(d)CUMS+AAV-βCaMKⅡ RNAi;(e)WT+AAV-control;(f)WT+AAV-ββCaMKII。病毒感染2周后進行強迫游泳實驗和糖水偏好實驗等行為學測試;Western Blot技術檢測p38、p-p38、p-CREB、p-ATF2、COX-2等和關蛋白的表達;qPCR技術檢測COX-2的mRNA水平的表達;ELISA技術檢測PGE2的含量變化。(5)將Wistar雄性大鼠隨機分為:(a)空白對照組;(b)CUMS組;(c)p38 阻斷劑(SB203580)預處理組(SB203580+CUMS,1Oug/kg);(d)溶劑對照組(DMSO+CUMS,1%)。每次應激刺激前30分鐘給予大鼠側腦室注射SB203580或者1%DMSO,5周后進行強迫游泳實驗和糖水偏好實驗等行為學測試。采用Western Blot、qPCR等技術檢測相關指標的變化。研究結果:(1)行為學測試結果顯示:與空白對照組相比,CUMS組大鼠在強迫游泳實驗中靜止不動的時間顯著延長(P0.05),在糖水偏好實驗中糖水消耗百分比明顯減少(P0.05),提示大鼠產生行為絕望和快感缺失等抑郁樣行為。(2)與空白對照組相比,CUMS組大鼠海馬CA1區(qū)COX-2表達增加,βCaMKII磷酸化水平升高,PGE2含量增高;激光共聚焦結果顯示小膠質細胞和星形膠質細胞數量增多,呈激活狀態(tài),且IL-1 β、TNF-α、IFN-γ等炎癥因子表達增加;而Celecoxib可有效抑制神經炎癥的發(fā)生,并顯著改善大鼠的抑郁樣行為。(3)與空白對照組相比,Western Blot結果顯示:CUMS組Nrf-2、HO-1表達量減少,SOD、CAT、T-AOC酶活性降低,同時,MDA和NO生成增加、LDH酶含量升高;激光共聚焦檢測結果顯示DHE、4-HNE高表達,ROS水平顯著增加,8-OHdG標記細胞核內DNA損傷程度增加,提示抑郁樣大鼠海馬CA1區(qū)氧化應激反應增強。(4)在正常對照大鼠海馬CA1區(qū)注射AAV-βCaMKⅡ過表達序列后,Western Blot結果顯示:與空白對照組相比,過表達βCaMKⅡ后,p38、p-p38、p-CREB、p-ATF2、COX-2表達量均升高。(5)在抑郁癥大鼠海馬CA1區(qū)注射AAV-βCaMKⅡ-RNAi后,與CUMS組相比,p-P38、p-CREB、p-ATF2、COX-2等相關蛋白表達量均降低。(6)與CUMS組相比,給予大鼠SB203580預處理,可顯著降低p-CREB、p-ATF2、COX-2等相關蛋白的表達,并明顯抑制大鼠抑郁樣行為的發(fā)生。結論:(1)CUMS能夠有效誘導大鼠抑郁樣行為的發(fā)生,并伴隨著大鼠海馬CA1區(qū)βCaMKⅡ的表達量升高。(2)βCaMKⅡ通過調控p38-COX2-PGE2信號通路介導慢性應激刺激導致的神經炎癥和氧化應激反應,從而介導抑郁癥狀的發(fā)生。 【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R749.4

【圖文】：

圖１．慢性不可預知性溫和刺激（ＣＵＭＳ）模型建立流程圖

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