【摘要】：目的： 應(yīng)用大腦中動(dòng)脈栓塞法制備腦卒中大鼠模型,將成模后的大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用慢性不可預(yù)見的溫和性刺激聯(lián)合孤養(yǎng)制備卒中后抑郁大鼠模型。成模后將兩組大鼠處死取額葉及海馬組織,應(yīng)用高效液相色譜法測定各組大鼠額葉及海馬五羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)及多巴胺(DA)的含量；蛋白免疫印跡法測定各組大鼠額葉、海馬中FGF-2蛋白的表達(dá)水平；實(shí)時(shí)定量PCR檢測兩組大鼠額葉中FGF-2的mRNA表達(dá),來研究卒中后抑郁大鼠腦內(nèi)五羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)及成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)的含量的變化規(guī)律,探討其與卒中后抑郁的關(guān)系。 方法： 1.采用改良的Koizumi線栓法(MCAO)對(duì)大鼠中動(dòng)脈阻塞制備腦卒中大鼠模型。模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：神經(jīng)功能評(píng)分：按Zea Longa等[2]神經(jīng)功能5分制評(píng)分。手提大鼠離開地面約1尺,觀察兩前肢的狀況；將大鼠置于水平地面,推動(dòng)其雙肩,觀察雙側(cè)抵抗力有無差異；大鼠置于地面,觀察其行走情況。采用五級(jí)評(píng)分法(0-4分),分?jǐn)?shù)越高,說明其神經(jīng)行為損傷越嚴(yán)重。 (1)行為完全正常者,記0分； (2)提起大鼠尾巴離開地面,手術(shù)對(duì)側(cè)前肢內(nèi)旋、內(nèi)收者,記1分 (3)將大鼠置于地面,用手?jǐn)D壓兩側(cè)檢查其抵抗力,手術(shù)對(duì)側(cè)抵抗力下降者,記2分； (4)將大鼠置于地面,觀察其行走,圍繞手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈者,記3分； (5)損傷及其嚴(yán)重,已經(jīng)無法自主活動(dòng)者,記4分。 術(shù)后評(píng)1-3分者為手術(shù)成功的標(biāo)志。0分、4分均視為模型制作失敗。將成模后的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。2.實(shí)驗(yàn)組從術(shù)后第7天開始為期21d,按Willner方法[3]改進(jìn)的慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress, CMS)。CMS包括：①禁食禁水20小時(shí)；②禁水17小時(shí)；③傾斜鼠籠(45°)17小時(shí)；④持續(xù)光照17小時(shí)；⑤濕籠(100克鋸屑+200毫升水)21小時(shí)；⑥4℃游泳5分鐘；⑦水平搖晃5分鐘；⑧行為限制2小時(shí)；⑨夾尾1分鐘。結(jié)合孤養(yǎng),9種刺激每日隨機(jī)采取1種,共21天制備卒中后抑郁大鼠模型。于大鼠卒中造模成功后(術(shù)后21d)行敞箱實(shí)驗(yàn)。大鼠穿越底面塊數(shù)為水平活動(dòng)得分,一般情況大鼠靠邊行走,穿越1格為1次,如果大鼠按直徑方向行走,每行走l0cm為1次。大鼠直立次數(shù)為垂直活動(dòng)得分,大鼠雙足離開底面為垂直活動(dòng),大鼠站立無論多長時(shí)間直至雙足放下為1次活動(dòng)。進(jìn)行下一只大鼠測定之前徹底清潔敞箱,每次測定時(shí)間為5min。 3.應(yīng)用高效液相法檢測各組大鼠額葉及海馬中五羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)及多巴胺(DA)的含量。4.采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組大鼠額葉、海馬中FGF-2蛋白的表達(dá)水平。大鼠額葉及海馬經(jīng)蛋白質(zhì)抽提試劑(1mL抽提試劑中加入5μL蛋白酶抑制劑混合液),5μL苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)和5μL磷酸酶混合液提取蛋白質(zhì),考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。蛋白變性后取50μg進(jìn)行20%十二烷基硫磺胺-聚丙烯酰胺電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE),結(jié)束凝膠電泳之后,通過轉(zhuǎn)移電泳方式將凝膠上分離到的蛋白條帶轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF),然后分別用非標(biāo)記一抗(rabbit anti-fibroblast growth factor-2)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(山羊抗兔抗體)進(jìn)行孵育、檢測。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence, ECL)顯影,X光片暗室中感光,采用美國UVP分析儀器,對(duì)膠片進(jìn)行掃描,然后括住每一個(gè)條帶,系統(tǒng)自動(dòng)生成灰度值,即為結(jié)果。 5.采用實(shí)時(shí)定量PCR(RealTimePCR)檢測各組大鼠額葉中FGF-2的mRNA表達(dá)。將大鼠額葉組織破碎后,用Triziol法提取總RNA,然后用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。構(gòu)建聚合酶體系,見表1。Taq酶(Promega)催化。熱循環(huán)：95℃預(yù)熱5min,94℃20s,退火20s,72℃30s,40個(gè)循環(huán)。各樣品目的基因和管家基因分別進(jìn)行SYBR熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng),檢測FGF-2 mRNA表達(dá)水平,結(jié)果為梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品目的基因校正后的相對(duì)含量(目的基因與內(nèi)參比值)(x±s),并分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的含量。 結(jié)果： 1.本研究對(duì)60只大鼠應(yīng)用線栓法制備腦卒中,45只大鼠制模成功,成模率為75.0%。 2.對(duì)23只大鼠應(yīng)用CMS聯(lián)合孤養(yǎng)制備卒中后抑郁大鼠,20只大鼠造模成功,成模率為86.9%。 3.實(shí)驗(yàn)組大鼠腦中額葉及海馬5-HT、NE及DA的含量顯著低于對(duì)照組(P0.01) 4. Western blot研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠的額葉FGF-2的蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P0.01),海馬組織中FGF-2蛋白表達(dá)差異不顯著(P0.05)。 5.實(shí)時(shí)定量PCR研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠的額葉的FGF-2的mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P0.01)。 結(jié)論： 1.卒中后抑郁大鼠腦中額葉及海馬的單胺類遞質(zhì)的水平下降與卒中后抑郁的發(fā)病有一定的聯(lián)系。 2.卒中后抑郁大鼠額葉FGF-2蛋白的表達(dá)水平下降是引起卒中后抑郁的原因之一 3.卒中后抑郁fgf-2 mRNA表達(dá)下調(diào)是引起腦內(nèi)FGF-2蛋白表達(dá)水平下降的原因。 4.額葉在卒中后抑郁的發(fā)病中起主要作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R749.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2709216