【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的兩大重要的病理學(xué)特征是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的大量神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)和神經(jīng)細(xì)胞間的大量老年斑(senile plaques,SP),臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶減退。神經(jīng)原纖維纏結(jié)主要由異常過度磷酸化的骨架蛋白tau構(gòu)成,而老年斑的核心成分是由β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)降解產(chǎn)生的β-淀粉樣多肽(β-amyloid, Aβ)。目前AD的發(fā)病機(jī)制仍不清楚,解釋其發(fā)病機(jī)制的主要學(xué)說有“tau異常學(xué)說”和“Aβ毒性學(xué)說”,但孤立地用一種學(xué)說不能全面地解釋AD腦中的病理改變。雖然存在很多發(fā)病過程,但其確切的影響因素和發(fā)病機(jī)制至今仍未完全明了。 同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是甲基化循環(huán)的一個(gè)中間產(chǎn)物,它在細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA和脂類的甲基化中起重要作用。流行病學(xué)調(diào)查和臨床研究發(fā)現(xiàn),AD的發(fā)生與血漿的Hcy關(guān)系密切,高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia,HHcy)是AD強(qiáng)而獨(dú)立的危險(xiǎn)因子。我們在本研究中,利用大鼠經(jīng)尾靜脈注射Hcy14天,或輔飼葉酸和維生素B12進(jìn)行治療,來探討HHcy是否引起大鼠出現(xiàn)AD樣改變及其可能的機(jī)制。 第一部分 同型半胱氨酸誘導(dǎo)大鼠海馬tau蛋白過度磷酸化及其機(jī)制研究 在本實(shí)驗(yàn)中,我們利用青年健康的雄性SD大鼠,經(jīng)尾靜脈注射Hcy復(fù)制HHcy模型,來研究大鼠是否出現(xiàn)AD樣tau蛋白磷酸化并探討其機(jī)制。具體的方法和結(jié)果如下: 一、Hcy升高對大鼠海馬tau蛋白磷酸化的影響 為了研究Hcy對tau蛋白磷酸的影響,大鼠尾靜脈注射Hcy 400μg/kg/day 3、7、14、21天,結(jié)果顯示:tau蛋白在Ser396和Ser199/Ser202位點(diǎn)出現(xiàn)過度磷酸化,并且磷酸化的程度隨著時(shí)間的延長而加重。然后我們用兩個(gè)不同的Hcy劑量(400μg /kg/day或1600μg /kg/day)對大鼠注射14天,或同時(shí)輔以葉酸和維生素B12作治療組,用相關(guān)抗體進(jìn)行Western-blotting檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)tau蛋白出現(xiàn)多位點(diǎn)的磷酸化;免疫組化和銀染的結(jié)果與上述一致,葉酸和B12能減輕Hcy的此種效應(yīng)。Hcy的劑量升高到1600μg/kg/day時(shí),除Thr205和Ser214兩個(gè)位點(diǎn)外,其余位點(diǎn)的磷酸化沒有進(jìn)一步增加。因此,我們就選擇Hcy 400μg/kg/day的量注射大鼠14天,作為機(jī)制探討的模型,來進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。 二、HPLC測定的血液中Hcy濃度 為了證實(shí)大鼠tau蛋白出現(xiàn)的過度磷酸化是Hcy濃度升高所致,我們采用高壓液相色譜檢測大鼠血漿中的Hcy的濃度。經(jīng)過14天的Hcy注射,血漿中的Hcy濃度顯著的升高,當(dāng)增補(bǔ)葉酸和B12后明顯的降低Hcy的濃度。這些結(jié)果表明提高血液中的Hcy能誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)AD樣多位點(diǎn)的磷酸化。 三、血漿中Hcy的升高對PP-2A和GSK-3活性的影響及與活性相關(guān)的修飾我們用32P-ATP檢測了PP-2A的活性,發(fā)現(xiàn)注射Hcy后,海馬神經(jīng)元PP-2A的活性降低40%。Western-blotting檢測發(fā)現(xiàn)PP-2Ac總的表達(dá)水平?jīng)]有變化,PP-2Ac的Leu309的甲基化(活性形式)水平顯著降低,而Leu309去甲基化水平(失活形式)顯著提高。我們又檢測了PP-2Ac的磷酸化,發(fā)現(xiàn)PP-2Ac Tyr307位點(diǎn)的磷酸化顯著增加,與PP-2Ac Leu309位點(diǎn)的去甲基呈正相關(guān)。當(dāng)增補(bǔ)葉酸和B12時(shí),PP-2A的活性可以恢復(fù)至對照組的85%,并增加Leu309位點(diǎn)的甲基化和降低Tyr307位點(diǎn)磷酸化。這些說明Hcy通過阻斷PP-2Ac的甲基化和增加PP-2Ac的磷酸化來抑制PP-2A的活性。 GSK-3是AD中一個(gè)關(guān)鍵的激酶,我們利用32P-ATP檢測它的活性,發(fā)現(xiàn)各組間沒有顯著性差異;Western-blotting顯示,GSK-3總的表達(dá)水平和Ser-9位點(diǎn)的磷酸化水平無明顯變化。這就可以排除GSK-3參與了Hcy誘導(dǎo)大鼠tau蛋白的過度磷酸化。 我們又檢測了調(diào)節(jié)PP-2Ac甲基化的兩個(gè)酶:甲酯酶(PME)和S-腺苷甲硫氨酸依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶(PPMT)表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPMT的表達(dá)水平各組間無差異,但在Hcy組PME的表達(dá)水平顯著增加,這就表明Hcy注射引起PP-2Ac的去甲基化是由PME導(dǎo)致的,增補(bǔ)葉酸和維生素B12可以部分恢復(fù)Hcy導(dǎo)致的PME的升高。 四、PP-2Ac去甲基化對PP-2A生物學(xué)功能的影響 為了探討Hcy誘導(dǎo)的PP-2Ac去甲基化對PP-2Ac生物學(xué)功能的影響,我們用總PP-2A抗體進(jìn)行免疫沉淀,用Western-blotting檢測發(fā)現(xiàn),PP-2Ac的總量各組間無變化,但Hcy組的去甲基化水平和磷酸化水平比對照組顯著增加,且沉淀物中PP-2AB顯著減少,說明PP-2Ac的去甲基化降低了PP-2Ac結(jié)合調(diào)節(jié)B亞基的能力。接著用去甲基化的PP-2Ac抗體免疫沉淀,發(fā)現(xiàn)沉淀中去甲基化的PP-2Ac同時(shí)被磷酸化,PP-2Ac的去甲基化和磷酸化間有高度的正相關(guān);增補(bǔ)葉酸和維生素B12可以減輕Hcy引起的這些變化。這些結(jié)果表明PP-2Ac的去甲基化可以促進(jìn)它的磷酸化,并共同抑制PP-2A的活性。 五、甲基化修飾的PP-2Ac和磷酸化tau蛋白在Hcy誘導(dǎo)的大鼠海馬和AD腦中的相互關(guān)系和分布 為了探討去甲基化的PP-2Ac和磷酸化的tau蛋白共定位關(guān)系,我們用甲基化的PP-2Ac、去甲基化的PP-2Ac和PS396抗體進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hcy組大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化顯色明顯加強(qiáng),同時(shí)去甲基化PP-2Ac的免疫活性也相應(yīng)增加;但是甲基化PP-2Ac的顯色顯著減弱。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)只有去甲基化的PP-2Ac與磷酸化的tau蛋白共定位,而甲基化的PP-2Ac與磷酸化的tau蛋白完全不共定位。上述這種定位關(guān)系在AD病人腦海馬中也同樣顯著。這些結(jié)果強(qiáng)烈說明了在Hcy誘導(dǎo)的大鼠腦和AD病人腦中,PP-2Ac的去甲基化導(dǎo)致了tau蛋白的磷酸化。 結(jié)論 在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)提高血液中的Hcy能通過失活PP-2A來導(dǎo)致tau的磷酸化。致使PP-2A失活的機(jī)制主要是PP-2Ac的去甲基化,并由此導(dǎo)致PP-2Ac的磷酸化和PP-2Ac結(jié)合PP-2AB亞基的能力降低。PME表達(dá)增加可能是Hcy升高時(shí)引起PP-2Ac去甲基化機(jī)制。同時(shí)增補(bǔ)葉酸和維生素B12可以部分的恢復(fù)血漿Hcy的水平,并減輕PP-2Ac的異常修飾和降低tau蛋白的磷酸化。 第二部分同型半胱氨酸誘導(dǎo)大鼠空間記憶障礙和Aβ增多并聚集的機(jī)制 我們在本實(shí)驗(yàn)中,用同型半胱氨酸進(jìn)行大鼠尾靜脈注射14天,復(fù)制高同型半胱氨酸血癥模型,來探討Hcy引起大鼠空間記憶障礙和Aβ產(chǎn)生增加的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下: 一、Hcy升高對大鼠海馬APP代謝的影響 為了研究Hcy升高對大鼠海馬內(nèi)APP的代謝影響,我們采用尾靜脈注射Hcy 400μg/kg/day,分為3、7、14、21天。結(jié)果顯示:4G8和6E10的顯色加深,說明APP在β-位點(diǎn)的切割增加,并隨著時(shí)間的延長而增加。 因?yàn)?4天的Hcy注射能顯著的誘導(dǎo)APP蛋白分解代謝變化,然后我們用兩個(gè)不同的Hcy劑量(400μg /kg/day或1600μg /kg/day)注射大鼠14天,或同時(shí)輔以葉酸和維生素B12治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)劑量都能導(dǎo)致APP在β-位點(diǎn)的切割增加,葉酸和維生素B12對上述有拮抗作用。當(dāng)Hcy的劑量升高到1600μg/kg/day時(shí),Aβ的產(chǎn)生沒有進(jìn)一步增加。因此,我們就選擇Hcy 400μg/kg/day的量注射大鼠14天,作為機(jī)制探討的模型, 我們利用大鼠腦切片,用Aβ的抗體免疫組化和用Thioflavin-S染色,結(jié)果進(jìn)一步證明,Hcy升高可以導(dǎo)致大鼠皮質(zhì)和海馬Aβ的產(chǎn)生增加,并且葉酸和B12能減輕Hcy的此種作用。說明了Hcy導(dǎo)致AD樣毒性部分是通過Aβ的產(chǎn)生增加而致。 二、Hcy對大鼠空間記憶的影響 為了證明Hcy引起了大鼠行為學(xué)的損傷,我們采用Morris水迷宮的方法檢測大鼠的空間記憶情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HHcy可以明顯的損傷大鼠的空間記憶能力,其中以低劑量的Hcy結(jié)果最明顯。葉酸和維生素B12可以拮抗Hcy的作用,提高大鼠的記憶能力。 三、ELISA測定大鼠皮質(zhì)和海馬Aβ40的含量 用ELISA的方法測定大鼠皮質(zhì)和海馬Aβ40的實(shí)際含量。兩個(gè)不同劑量的Hcy注射14天后,大鼠皮質(zhì)和海馬Aβ產(chǎn)生的量顯著升高,以低劑量的Hcy最明顯,并且皮質(zhì)的變化最顯著,當(dāng)輔飼葉酸和維生素B12后,能明顯的降低Aβ的產(chǎn)生。 四、RT-PCR檢測APP及其代謝分泌酶基因水平的變化 用相應(yīng)引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除γ-分泌酶的PS1基因在mRNA水平表達(dá)升高外,其余酶和蛋白在RNA水平均無顯著性變化。當(dāng)加飼葉酸和維生素B12后,能顯著降低γ-分泌酶PS1在RNA水平上的變化。這說明Aβ增加不是因?yàn)锳PP表達(dá)水平的改變引起,而是受其代謝變化或其它變化影響所致。 五、翻譯后蛋白水平的檢測 因?yàn)锳PP和α-、β-分泌酶在基因水平上沒有改變,接著我們用Western-blotting來檢測β-和γ-分泌酶PS2的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們在翻譯水平上也無明顯的改變。因?yàn)橛?G8和6E10兩抗體檢測,β切割產(chǎn)生的片段呈強(qiáng)陽性反應(yīng),且Aβ的產(chǎn)生量顯著增加,我們就用p-Thr668-APP抗體(識別磷酸化的APP Thr668位點(diǎn))檢測APP磷酸化的修飾情況,發(fā)現(xiàn)APP在Thr668位點(diǎn)的磷酸化加強(qiáng),與對照組相比有顯著的差異性,葉酸和維生素B12能顯著降低這種變化。免疫組化結(jié)果與Western-blotting結(jié)果一致。說明Hcy導(dǎo)致APP出現(xiàn)了異常磷酸化修飾. 六、磷酸化APP對自身代謝的影響 為了進(jìn)一步探討磷酸化修飾的APP對自身代謝的影響,我們又用磷酸化p-Thr668-APP的抗體去免疫沉淀,結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸化的APP陽性顯色增加,還可以見切割的磷酸化APP片段;并且沉淀中BACE1和PS2數(shù)量顯著升高;葉酸和維生素B12對上述Hcy的影響有拮抗作用。這說明APP磷酸化修飾后,增加了與β-和γ-分泌酶的親和力,使APP便于β、γ-分泌酶切割,因此導(dǎo)致了Aβ的產(chǎn)生增加。 結(jié)論 總之在本實(shí)驗(yàn)中, HHcy一方面通過增加PS1的表達(dá),提高γ-分泌酶的活性,另一方面通過增加APP Thr668的磷酸化修飾,增加APP與分泌酶的親和性,致使Aβ產(chǎn)生增多。增補(bǔ)葉酸和維生素B12可以部分的恢復(fù)血漿Hcy的水平的同時(shí),并減輕PS1的表達(dá)和APP的異常修飾,降低Aβ的產(chǎn)生和聚集。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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1 高平,秦紹森,肖路延,蔡曉杰;高同型半胱氨酸血癥與Alzheimer病的關(guān)系[J];中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志;2005年03期

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本文編號：2704066