【摘要】： 第一章NOTCH3基因突變的研究 目的通過(guò)對(duì)臨床擬診伴皮層下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病(CADASIL)患者進(jìn)行NOTCH3基因的2-23外顯子突變檢測(cè),對(duì)疾病作出基因診斷。 方法采用DNA直接測(cè)序方法對(duì)25例臨床擬診CADASIL先證者進(jìn)行NOTCH3基因的2-23外顯子突變檢測(cè)；并對(duì)已發(fā)現(xiàn)突變的先證者8個(gè)家系成員共116人,進(jìn)行突變外顯子檢測(cè)；正常對(duì)照組100樣本進(jìn)行NOTCH3基因測(cè)序。 結(jié)果①發(fā)現(xiàn)9例NOTCH3基因突變(35%),突變分別分別位于第3外顯子的R90C,第4外顯子的R133C、R153C、C185Y、R182C(2例)、R133S及第11外顯子的R544C(2例),均為錯(cuò)義點(diǎn)突變。②第4外顯子的R133S突變是一種新的保留半胱氨酸的NOTCH3基因突變。③1例散發(fā)患者存在位于第4外顯子的R182C突變。 結(jié)論①首次報(bào)道4外顯子的R133S突變是一種新的保留半胱氨酸的NOTCH3基因突變。②國(guó)內(nèi)首次報(bào)道1例散發(fā)患者存在第4外顯子的R182C突變。 第二章NOTCH3蛋白及GOM對(duì)CADASIL診斷價(jià)值的研究 目的探討KLH法制備的NOTCH3氨基端(N)多克隆抗體及GOM對(duì)CADASIL診斷價(jià)值。 方法應(yīng)用人工合成NOTCH3氨基端(N)一個(gè)多肽片段,通過(guò)KLH方法制備全新NOTCH3N-末端多克隆抗體,通過(guò)純化后、經(jīng)ELISA法及Western blot證實(shí)得到的抗體為抗NOTCH3N-末端的特異抗體。31例CADASIL患者及25例匹配的非CADASIL對(duì)照患者分別行皮膚活檢,通過(guò)電子顯微鏡觀察血管超微結(jié)構(gòu)改變,并評(píng)估其超微結(jié)構(gòu)GOM沉積,以及NOTCH3N-末端多克隆抗體的免疫組化方法的敏感性和特異性。 結(jié)果①成功的制作了NOTCH3N-末端多克隆抗體。②31例患者的皮膚血管超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)：大多數(shù)血管壁增厚,顆粒樣嗜鋨性物質(zhì)主要沉積在小動(dòng)脈和小靜脈血管平滑肌細(xì)胞表面,偶爾位于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍。血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞變性,它們細(xì)胞質(zhì)中充滿許多嗜鋨性物質(zhì)小泡以及線粒體空泡樣變性。25例對(duì)照中僅1例老年人中偶見(jiàn)血管基底膜增厚。③31例CADASIL患者超微結(jié)構(gòu)GOM沉積的敏感性為54.5%,特異性為96%；而用NOTCH3N-末端多克隆抗體的免疫組化方法的敏感性為75.7%,特異性為98%；將兩種方法結(jié)合其敏感性為91%,特異性為97%。 結(jié)論這種全新的NOTCH3N-末端特異性抗體的免疫組化方法結(jié)合電鏡超微結(jié)構(gòu)GOM能有效提高CADASIL確診率。 第三章NOTCH3蛋白與GOM關(guān)系的研究 目的探討NOTCH3蛋白與GOM兩者之間關(guān)系。揭示GOM的生物化學(xué)特性和來(lái)源。 方法應(yīng)用人工合成NOTCH3氨基端(N)及NOTCH3羧端(C)兩個(gè)多肽片段,通過(guò)KLH方法制備抗NOTCH3N-末端多克隆抗體和NOTCH3C-末端多克隆抗體,純化后、經(jīng)ELISA法及Western blot證實(shí)得到的兩個(gè)抗體均為特異抗體。9例CADASIL患者及25例匹配的非CADASIL對(duì)照患者分別行皮膚活檢,其中2例CADASIL患者行腦組織活檢,而2例非CADASIL患者腦組織作為對(duì)照,利用免疫電子顯微鏡技術(shù)揭示GOM與NOTCH3受體外側(cè)和內(nèi)側(cè)結(jié)構(gòu)域的關(guān)系。 結(jié)果①成功的制備NOTCH3N-末端多克隆抗體和NOTCH3C-末端多克隆抗體。②CADASIL患者腦組織和皮膚血管平滑肌細(xì)胞表面均有GOM和NOTCH3N-末端抗體特異的膠體金顆粒沉積,無(wú)NOTCH3C-末端抗體特異的膠體金顆粒沉積；這些NOTCH3N-末端抗體特異的膠體金顆粒沉積鄰近GOM,或位于GOM內(nèi)。③對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)GOM的沉積及NOTCH3抗體膠體金顆粒沉積。 結(jié)論GOM的主要成分可能為NOTCH3受體外側(cè)結(jié)構(gòu)域,揭示GOM生物學(xué)特性和它與NOTCH3基因的關(guān)系,為進(jìn)一步揭示CADASIL的病理機(jī)理提供新的研究思路。
【圖文】：

NOTCH3N一末端多克隆杭體Westernblo晚疫印跡鑒定1:NOTCH3N一末端多克隆杭體;2:陰性對(duì)照

一l第4外顯子PeR電泳圖(399bp)
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R749.13

【引證文獻(xiàn)】

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1 張永梅;陳桂生;張國(guó)榮;顏虹杰;姜丹;張尼娜;宗廷勇;;1例伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病患者的家系分析及基因檢測(cè)[J];中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué);2013年04期

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本文編號(hào)：2700586