發(fā)布時間：2020-06-06 01:15

【摘要】：【目的】探討大鼠骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)體外分離、培養(yǎng)、純化、傳代、鑒定和標記的方法,為進行BMSCs移植治療血管性癡呆(Vascular dementia, VD)大鼠模型提供功能穩(wěn)定的種子細胞。 【方法】采用全骨髓細胞培養(yǎng)貼壁篩選法在體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs,相差顯微鏡觀察BMSCs細胞形態(tài),透射電鏡觀察BMSCs超微結構并繪制生長曲線,使用地塞米松等物質誘導其向成骨細胞和脂肪細胞兩個方向分化。用BrdU對BMSCs進行體外標記,通過免疫組化染色觀察并計算BrdU陽性細胞標記率。①選取3-4W齡SD大鼠,從其股骨中取材,在無菌條件下操作,用剪刀剪去股骨的兩端,暴露骨髓腔,用含15%胎牛血清(FBS)的DMEM-LG完全培養(yǎng)基從骨髓腔中沖出骨髓于平皿中,并用同樣含15%FBS的DMEM-LG完全培養(yǎng)基培養(yǎng),用消化控制和全骨髓細胞貼壁分離法分離純化BMSCs,觀察其生長狀態(tài),相差顯微鏡觀察BMSCs的細胞形態(tài),透射電鏡觀察BMSCs超微結構并繪制生長曲線。②取生長旺盛的第3代細胞,用流式細胞儀檢測BMSCs表面抗原CD34(PE標記)、CD90 (FITC標記)、CD44 (FITC標記)及同型對照小鼠抗大鼠IgG1型單克隆抗體(分別為PE和FITC標記)。并分別以誘導其向骨細胞分化及向脂肪細胞分化的方法對分離擴增的BMSCs進行鑒定。③用5-溴-2’-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)免疫組化染色方法對第3代細胞BMSCs進行體外標記,通過免疫組化染色觀察并計算BrdU陽性細胞標記率。 【結果】①原代培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs為大小不等圓形細胞。純化、擴增后BMSCs呈均勻一致的長梭型,傳代后的BMSCs形態(tài)趨于均一,排列有序,呈魚群樣或漩渦狀排列。BMSCs超微結構見SD大鼠BMSCs細胞體積較小,核質比例較大,細胞核呈橢圓形,也可見不規(guī)則形,核仁1-2個大而明顯,核染色質較疏松,細胞表面可見有較多微絨毛,胞質中可見較豐富的細胞器,如線粒體、粗面內質網和高爾基體。傳代周期為8-9d,細胞接種后1～2 d為滯留期,3d后達對數(shù)生長期,第6天進入平臺期。②流式細胞儀檢測第3代細胞示,CD44陽性率為89.4%、CD90為99.2%,CD34為1.82%。經誘導BMSCs向骨細胞分化后,茜素紅S染色可見鈣結節(jié)陽性。經誘導BMSCs向脂肪細胞分化后,油紅O染色,蘇木素復染,細胞內可見圓形脂滴空泡,被油紅O染成特異性橘紅色。③10μmol/LBrdU體外孵育48h后BrdU陽性細胞呈棕黃或黃褐色,陽性反應物位于細胞核,標記率為89%～92%。 【結論】體外BMSCs易于分離、培養(yǎng)和擴增。體外培養(yǎng)的BMSCs有獨特的超微結構特點。BMSCs可通過誘導向成骨細胞和脂肪細胞分化。用BrdU標記BMSCs的濃度為10μmol/L,時間為48h。 【目的】研究立體定位海馬移植同種異體BMSCs,對VD大鼠模型的學習記憶功能障礙改善的療效、腦組織病理學改變、腦組織中移植BMSCs的存活遷移情況等的影響。 【方法】①用2-VO法制作血管性癡呆大鼠模型,將11～13月齡的SD大鼠隨機分成3組：假手術組10只,暴露雙側頸總動脈但不結扎；培養(yǎng)組基對照15只,結扎雙側頸總動脈(2-VO),30d后腦立體定位將10μl PBS注入大鼠海馬內；BMSCs移植組15只,2-VO 30d后腦立體定位將1×106BMSCs移植入大鼠海馬內。②飼養(yǎng)實驗大鼠4w后以Morris水迷宮作定位航行試驗和空間探索實驗檢測各組大鼠空間學習記憶能力。③HE染色后光鏡下觀察各組大鼠海馬區(qū)和額葉皮質的病理變化。④免疫組織化學染色觀察BrdU標記的BMSCs在VD大鼠腦組織中的存活及遷移情況進行研究。 【結果】①造模前各組大鼠Morris水迷宮檢測成績差別無統(tǒng)計學意義,海馬定位移植4w后,模型對照組與假手術組比較,平均逃避潛伏期長(P0.01),且60s內在平臺象限滯留時間短(P0.01)。BMSCs移植組逃避潛伏期比模型對照組明顯縮短(P0.01), BMSCs移植組在平臺象限滯留時間較模型對照組長(P0.05)。但都達不到假手術組的水平(P0.01)。②光鏡下可見模型對照組大鼠海馬及額葉皮質的細胞排列不齊,細胞核固縮,胞質密度增高,細胞脫失。而BMSCs移植組上述病理改變較輕。③BMSCs移植組經海馬定位移植BMSCs 4w后,可在實驗大鼠海馬觀察到呈棕黃或黃褐色的BrdU標記BMSCs,有局灶聚集現(xiàn)象。額葉也見少量分散的BrdU陽性細胞。 【結論】①BMSCs海馬定位移植治療使VD模型大鼠空間學習記憶能力得到改善,但未達到假手術組水平。②BrdU免疫組化染色證實海馬定位移植的BMSCs能在海馬存活,并且能夠在移植大鼠腦內遷移。 【目的】研究甘露醇預處理對同種異體BMSCs靜脈移植治療VD模型大鼠學習記憶功能障礙改善療效的影響,通過觀察實驗大鼠腦組織腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)含量、血管內皮生長因子(VEGF)及海馬膽堿能系統(tǒng)活性,探討甘露醇預處理后BMSCs靜脈移植治療VD模型大鼠療效的機制。 【方法】①造模成功后將VD模型大鼠隨機分成模型對照組8只(注射1ml無血清培養(yǎng)基)、BMSCs移植組11只(注射1×106個BMSCslml)及甘露醇預處理BMSCs移植組9只(注射1.5g/kg甘露醇后,在10-30分鐘之內注射1×106個BMSCslml)。還設假手術組7只,暴露雙側頸總動脈,但不結扎即縫合,不進行任何干預。②移植后籠養(yǎng)實驗大鼠4w后,Morris水迷宮作定位航行試驗和空間探索實驗檢測各組大鼠空間學習記憶能力。③HE染色觀察大腦病理結構的變化。④ELISA法檢測各組實驗大鼠腦組織BDNF含量變化。⑤ELISA法檢測各組實驗大鼠腦組織VEGF的含量變化。⑥檢測實驗大鼠海馬膽堿乙酰轉移酶(ChAT)和乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性。 【結果】①BMSCs靜脈移植4w后,大鼠空間學習記憶能力測試結果顯示,甘露醇預處理后BMSCs移植組和BMSCs移植組的逃避潛伏期均較培養(yǎng)基對照組明顯縮短(分別p0.01,p0.05),平臺象限平均滯留時間均延長(分別p0.01,p0.05)；甘露醇預處理后BMSCs移植組的逃避潛伏期比BMSCs移植組更明顯縮短,平臺象限平均滯留時間更長(p0.001)；甘露醇預處理后BMSCs移植組的的逃避潛伏期和平臺象限平均滯留時間與假手術組的差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。②BMSCs移植組額葉皮質組織HE染色病理片顯示其病理損傷較培養(yǎng)基對照組輕,神經元細胞數(shù)量較多,神經元腫脹、脫失及核固縮現(xiàn)象減少,而以甘露醇預處理后BMSCs移植組的病理損傷更輕。③BMSCs移植組海馬和額葉組織BDNF含量高于培養(yǎng)基對照組(P0.05)；甘露醇預處理BMSCs移植組海馬和額葉BNDF含量不但高于培養(yǎng)基對照組(P＜0.05),而且比BMSCs移植組更高(P＜0.05)；但是,尚未達到假手術組的水平(P0.05)。④甘露醇預處理BMSCs移植組、BMSCs移植組額葉組織VEGF含量均值比培養(yǎng)基對照組顯著增高(P=0.000)；甘露醇預處理BMSCs移植組額葉VEGF含量比BMSCs移植組更高(P=0.000)；與假手術對照組比較,培養(yǎng)基對照組大鼠額葉VEGF含量也升高(p=0.006)。⑤培養(yǎng)基組大鼠海馬組織AChE和ChAT活性較假手術組明顯減弱(P0.05); BMSCs移植組大鼠海馬組織AChE和ChAT活性較培養(yǎng)基組有明顯增強(P0.05)；甘露醇預處理BMSCs移植組大鼠海馬組織AChE和ChAT活性不僅比培養(yǎng)基組有更顯著增強(P0.05),而且比BMSCs移植組也顯增強(P0.05)。 [結論]用甘露醇預處理后靜脈移植同種異體BMSCs能使VD模型大鼠的學習及記憶能力的改善比單純靜脈移植BMSCs更明顯。BMSCs靜脈移植可減輕大腦的病理性損傷,而甘露醇預處理后行BMSCs靜脈移植的病理損傷更輕。提示甘露醇預處理可能增加了BBB通透性,使更多BMSCs進入腦內發(fā)揮作用。靜脈移植BMSCs4w時所獲的療效與腦內BDNF和VEGF表達升高,膽堿能神經系統(tǒng)活性增強有關。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R749.13

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 李旭光;吳波;游潮;;鑭示蹤甘露醇開放大鼠血腦屏障機制的實驗研究[J];長治醫(yī)學院學報;2007年06期

2 童林艷;胡長林;李晉芳;王志剛;程遠;;兩種不同開放血腦屏障方法的比較[J];第三軍醫(yī)大學學報;2007年18期

3 江遜,崔鵬程,陳文弦,趙大慶,張殿忠,張志培;人骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)及生物特性的觀察[J];第四軍醫(yī)大學學報;2003年04期

4 劉紅梅,高天明,佟振清;急性腦缺血動物模型實驗研究進展[J];第一軍醫(yī)大學學報;1999年04期

5 路艷蒙,傅文玉,樸英杰,喬東訪,安連兵;人骨髓間充質干細胞的超微結構[J];電子顯微學報;2002年04期

6 穆軍山;楊渤生;林航;;腦室內注射BDNF抗體對大鼠海馬NOS表達的影響[J];福州總醫(yī)院學報;2007年Z1期

7 高東;周中和;;實驗性血管性癡呆的模型制作問題[J];國外醫(yī)學(老年醫(yī)學分冊);2002年02期

8 楊龍秀;劉金萍;張?zhí)i;陳志;莫雪安;;甘露醇對骨髓間充質干細胞治療血管性癡呆大鼠行為學的影響[J];廣西醫(yī)科大學學報;2011年01期

9 梁雄安;曾慧明;鄧斌;;血管內皮生長因子及其受體在皮膚病中的研究進展[J];海南醫(yī)學院學報;2008年05期

10 呂佩源;靳瑋;馮志山;何春年;翟金萍;;雙氫麥角堿對血管性癡呆小鼠海馬乙酰膽堿酯酶活性變化的影響[J];神經疾病與精神衛(wèi)生;2008年02期

，

本文編號：2698910