【摘要】：研究背景阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease,AD)是一種典型的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。臨床上的表現(xiàn)特征為空間記憶能力損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變,病因迄今未明。阿爾茲海默癥是老年癡呆中最普遍的一種,其主要的病理特征包括胞外淀粉樣蛋白的沉積,胞內(nèi)默癥分為家族性和散發(fā)性?xún)煞N類(lèi)型,前者主要由遺傳因素導(dǎo)致,后者主要由遺傳因異常磷酸化的Tau蛋白所形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。阿爾茲海素和環(huán)境因素共同影響。據(jù)《世界阿爾茲海默病報(bào)告》顯示,到2050年全球阿爾茲海默病患者人數(shù)將達(dá)到1億3百萬(wàn)人。因此,對(duì)于阿爾茲海默的研究與尋找治療方法已經(jīng)迫在眉睫。而研究AD的分子機(jī)制對(duì)AD的治療方法的探索有著重要意義。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)控蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊修飾的重要細(xì)胞器,當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣離子平衡紊亂時(shí)會(huì)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress),進(jìn)而激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedproteinresponse,UPR)等信號(hào)通路。有研究表明,阿爾茲海默癥中Aβ的沉積可能導(dǎo)致神經(jīng)元中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活,進(jìn)一步導(dǎo)致UPR。并且AD患者細(xì)胞內(nèi)存在Ca2+濃度升高的現(xiàn)象,可能是由于Aβ影響了 Ca2+的釋放。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的主要信號(hào)通路有三條,包括PERK通路,IRE1通路,ATF6通路。前兩種通路研究較為深入,而關(guān)于ATF6通路與阿爾茲海默癥的研究卻相對(duì)較少。因此,本研究基于阿爾茲海默癥與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系,側(cè)重研究ATF6信號(hào)通路在阿爾茲海默癥中的作用機(jī)制,探究ATF6在AD病理形成過(guò)程中所扮演的角色,以期為AD的治療尋找新的潛在靶點(diǎn)。研究方法本研究首先在細(xì)胞水平探究ATF6作用的下游基因。利用p3xFlag-CMV-14-ATF6真核表達(dá)質(zhì)粒和ATF6敲低質(zhì)粒,通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN229進(jìn)行ATF6的過(guò)表達(dá)和敲低,應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)ATF6對(duì)Aβ1-42的影響,利用qPCR技術(shù)檢測(cè)AD相關(guān)候選基因的表達(dá)。利用Western blot方法檢測(cè)ATF6對(duì)AD相關(guān)蛋白的表達(dá)影響。其次,構(gòu)建基因啟動(dòng)子熒光質(zhì)粒,通過(guò)ATF6真核表達(dá)質(zhì)粒與啟動(dòng)子熒光質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染的方法,確定ATF6對(duì)基因的啟動(dòng)子的影響。最后,利用阿爾茲海默模型小鼠在動(dòng)物水平驗(yàn)證ATF6的作用。利用AD模型鼠APP/PS1小鼠,通過(guò)側(cè)腦室注射ATF6質(zhì)粒的方法實(shí)現(xiàn)小鼠腦中ATF6的過(guò)表達(dá),通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)Y迷宮及水迷宮檢測(cè)ATF6對(duì)其學(xué)習(xí)記憶能力的影響。通過(guò)ELISA的方法檢測(cè)ATF6對(duì)小鼠大腦皮層中Aβ1-42的影響,利用硫黃素S染色的方法檢測(cè)ATF6對(duì)Aβ蛋白斑的影響。研究結(jié)果1.AD模型小鼠與野生型小鼠腦組織ATF6的表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)AD模型小鼠腦中ATF6表達(dá)明顯降低(P0.05)。2.在細(xì)胞水平過(guò)表達(dá)ATF6,檢測(cè)細(xì)胞上清中Aβ1-42的水平明顯降低(P0.01),說(shuō)明ATF6抑制了淀粉樣蛋白的形成或者促進(jìn)了淀粉樣蛋白的降解。3.在細(xì)胞水平通過(guò)qPCR及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)ATF6后,與對(duì)照組相比APP蛋白水平明顯降低,RNA水平未見(jiàn)顯著性差異。ADAM17在蛋白及RNA水平均有顯著升高(P0.05),BACE1則在蛋白及RNA水平均有顯著下降(P0.001)。BACE1的異構(gòu)體BACE2蛋白及RNA水平均無(wú)明顯改變。敲低ATF6后得出相同的結(jié)果。4.通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證ATF6對(duì)ADAM1及BACE1的啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATF6對(duì)ADAM17的啟動(dòng)子區(qū)無(wú)顯著影響,而對(duì)BACE1的啟動(dòng)子活性有顯著抑制作用(P0.001)。通過(guò)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件及查閱文獻(xiàn)分析對(duì)BACE1啟動(dòng)子活性有影響的轉(zhuǎn)錄因子主要有SP1,P53,PPARγ,而通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明ATF6作用于BACE1的啟動(dòng)子區(qū)并不是通過(guò)以上轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。5.AD模型小鼠側(cè)腦室注射ATF6檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。Y迷宮結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,ATF6過(guò)表達(dá)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有顯著提高(P0.05)。水迷宮結(jié)果表明注射ATF6的模型鼠的認(rèn)知功能有顯著緩解(P0.01)。取小鼠腦組織發(fā)現(xiàn)注射ATF6小鼠大腦皮層中BACE1水平降低且Aβ蛋白斑減少。6.ATF6可以促進(jìn)H2S的生成,促進(jìn)細(xì)胞自噬。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中H2S主要由CBS產(chǎn)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CBS可以通過(guò)促進(jìn)ATG5巰基化促進(jìn)自噬,進(jìn)而緩解AD。但實(shí)驗(yàn)證明ATF6對(duì)CBS沒(méi)有影響。7.利用Cre/loxP重組酶系統(tǒng)構(gòu)建大腦皮層和海馬特異性敲除ATF6的AD小鼠模型,先雜交出大腦皮層和海馬特異ATF6敲除小鼠后與APP/PS1小鼠雜交得到大腦皮層及海馬特異性敲除ATF6的APP/PS1模型小鼠。目前小鼠模型已構(gòu)建成功,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)論AD模型小鼠腦中ATF6的表達(dá)明顯降低,ATF6通過(guò)抑制BACE1的啟動(dòng)子活性影響了 BACE1的表達(dá),進(jìn)而影響淀粉樣蛋白前體蛋白和Aβ的產(chǎn)生。同時(shí)影響了淀粉樣蛋白形成過(guò)程中的分泌酶的表達(dá)。AD小鼠模型側(cè)腦室注射ATF6可以減少小鼠腦中蛋白斑的沉積,并對(duì)模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有積極的影響,可以緩解模型小鼠的認(rèn)知障礙。為ATF6可能作為治療AD的潛在分子靶點(diǎn)提供了依據(jù)。
【圖文】：

１２月齡阿爾茲海默模型小鼠腦中有淀粉樣沉淀（ＡＰ）的沉積，為驗(yàn)證ＡＤ模型小逡逑鼠的表型，對(duì)ＡＰＰ／ＰＳ１模型小鼠腦中Ａ（３１－４２的水平進(jìn)行ＥＬＩＳＡ分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如逡逑圖４－１所示：逡逑Ａｐｌ－４２逡逑。勹邐＊逡逑Ｉ邐Ｔ逡逑ｗ邋０．４－邐ｒ逡逑■逡逑ｒ－門(mén)■逡逑ｏ．0Ｊ￣邐１邐邐＾—逡逑圖４－１．阿爾茲海默癥模型小鼠大腦皮層中Ａｐｌ－４２水平的ＥＬＩＳＡ檢測(cè)逡逑上圖結(jié)果顯示，阿爾茲海默癥模型小鼠（《＝４）大腦皮層中Ａ（３１－４２的水平明顯逡逑高于野生鼠（《＝４），說(shuō)明１２月齡模型鼠腦中已經(jīng)出現(xiàn)Ａｐ的沉積，已經(jīng)表現(xiàn)了阿逡逑爾茲海默癥的相關(guān)指征，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。逡逑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與阿爾茲海默癥的發(fā)生發(fā)展有著必要的聯(lián)系，為了確定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激逡逑信號(hào)蛋白ＡＴＦ６與阿爾茲海默癥的關(guān)系，進(jìn)一步檢測(cè)ＡＤ模型鼠中ＡＴＦ６的表達(dá)水逡逑平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖４－２所示：逡逑ＷＴ邋２ｘＴｇ逡逑ＡＴＦ６邋W邋Ｋ邐娍：５５ＫＤ逡逑ＧＡＰＤＨ邐３６ＫＤ逡逑圖４－２．邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)阿爾茲海默癥模型小鼠大腦皮層中ＡＴＦ６表達(dá)水平逡逑圖４－２結(jié)果說(shuō)明與同齡野生型小鼠相比，阿爾茲海默癥模型小鼠大腦皮層ＡＴＦ６逡逑表達(dá)水平明顯降低

１２月齡阿爾茲海默模型小鼠腦中有淀粉樣沉淀（ＡＰ）的沉積，為驗(yàn)證ＡＤ模型小逡逑鼠的表型，對(duì)ＡＰＰ／ＰＳ１模型小鼠腦中Ａ（３１－４２的水平進(jìn)行ＥＬＩＳＡ分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如逡逑圖４－１所示：逡逑Ａｐｌ－４２逡逑。勹邐＊逡逑Ｉ邐Ｔ逡逑ｗ邋０．４－邐ｒ逡逑■逡逑ｒ－門(mén)■逡逑ｏ．0Ｊ￣邐１邐邐＾—逡逑圖４－１．阿爾茲海默癥模型小鼠大腦皮層中Ａｐｌ－４２水平的ＥＬＩＳＡ檢測(cè)逡逑上圖結(jié)果顯示，阿爾茲海默癥模型小鼠（《＝４）大腦皮層中Ａ（３１－４２的水平明顯逡逑高于野生鼠（《＝４），說(shuō)明１２月齡模型鼠腦中已經(jīng)出現(xiàn)Ａｐ的沉積，已經(jīng)表現(xiàn)了阿逡逑爾茲海默癥的相關(guān)指征，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。逡逑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與阿爾茲海默癥的發(fā)生發(fā)展有著必要的聯(lián)系，為了確定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激逡逑信號(hào)蛋白ＡＴＦ６與阿爾茲海默癥的關(guān)系，進(jìn)一步檢測(cè)ＡＤ模型鼠中ＡＴＦ６的表達(dá)水逡逑平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖４－２所示：逡逑ＷＴ邋２ｘＴｇ逡逑ＡＴＦ６邋W邋Ｋ邐娍：５５ＫＤ逡逑ＧＡＰＤＨ邐３６ＫＤ逡逑圖４－２．邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)阿爾茲海默癥模型小鼠大腦皮層中ＡＴＦ６表達(dá)水平逡逑圖４－２結(jié)果說(shuō)明與同齡野生型小鼠相比，阿爾茲海默癥模型小鼠大腦皮層ＡＴＦ６逡逑表達(dá)水平明顯降低
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2696574